微生物法不對稱還原合成手性2-辛醇的研究.pdf

1、光學純2-辛醇是光電材料、醫(yī)藥、農藥和精細化工產品的重要手性中間體。通過開展生物法催化高效制備光學純2-辛醇，對于取代現有的化學法以及深入手性生物催化的研究具有重要的現實意義和理論價值。 本文從包括酵母、細菌和霉菌在內的菌株中篩選得到還原2-辛酮生成手性2-辛醇效果較好的2株菌株。其中CandidaboidiniiCECT10035能夠還原2-辛酮得到(S)-2-辛醇，當底物濃度為10g/L時，轉化率為32.6％，e.e.值為9

2、5.6％。另一株OenococcusoeniCECT4730則是能還原2-辛酮得到(R)-2-辛醇，在同樣底物濃度下，轉化率為99.8％，e.e.值為97.6％。酒明串珠菌具有較高的酮還原能力以及光學選擇性，是首次報道。 對OenococcusoeniCECT4730催化還原2-辛酮的反應體系進行研究，優(yōu)化其反應體系及反應條件為：細胞濃度250g/L，底物濃度0.5M，采用葡萄糖作為輔助底物，濃度為300mM，水相為300mMT

3、ris-Borate(TBE)緩沖液，pH為8.5，有機相為正壬烷，兩相比為1∶1，搖瓶轉速為150rpm，反應溫度30℃，反應48小時，在培養(yǎng)菌體過程中通CO2，同時反應前通惰性氣體N2作為保護氣，并保持厭氧。在最優(yōu)條件下，產物的光學純度提高至99％e.e.，轉化率保持99％。 在以上優(yōu)化過程中發(fā)現高濃度的底物，輔助底物和TBE緩沖液對反應有抑制，因此采用底物流加反應來降低以上因素對反應的抑制。其流加反應體系為：流加過程中細胞

4、濃度為180g/L，維持底物濃度為10g/L左右，同時將出發(fā)的TBE緩沖液pH改為7.5，流加過程中維持pH在7.5附近，流加中用于調節(jié)pH的Tris液濃度為0.3M，輔助底物葡萄糖也是0.3M。經過48小時的流加反應，產物濃度達到120g/L，并且轉化率和e.e.值均達到99％。 利用OenococcusoeniCECT4730還原不同酮化合物，發(fā)現其胞內的醇脫氫酶具有較廣的底物特異性，即能還原脂肪酮類化合物，又能還原芳香酮類

5、化合物，并且產物的光學純度都較高。在酮底物的選擇性上，尤其適合于還原在羰基一側具有一個甲基，在另一側有一個較大基團的酮化合物。通過對其粗酶的研究發(fā)現，其胞內的醇脫氫酶是NADPH依賴型的，并且在還原輔酶過程中的一個關鍵的酶是6-磷酸葡萄糖脫氫酶。 還研究了OenococcusoeniCECT4730在還原反應過程中的輔酶循環(huán)系統(tǒng)，其主要通過PK途徑代謝葡萄糖并用于再生輔酶，并且大約一分子的葡萄糖被代謝，就會再生二分子的NADPH

6、用于還原2-辛酮生成二分子2-辛醇，同時產生一分子的乳酸和乙酸。 針對輔酶再生體系的特性，發(fā)現添加離子和乙醇會提高其輔酶再生體系的轉化效率，通過反應優(yōu)化，確定在反應體系中添加2.5mM的Mn2+和Fe2+，以及10mM的乙醇。優(yōu)化后，單批次反應的轉化能力比之前的單批次優(yōu)化結果又提高50％。 最后利用CandidaboidiniiCECT10035全細胞催化手性合成(S)-2-辛醇，將其反應體系及反應條件優(yōu)化為：細胞濃度2