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文檔簡介
1、胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)/胚胎植入前遺傳學篩查(preimplantation genetic screening,PGS)是在輔助生殖技術(assisted reproductive techniques,ART)時,針對于有特定遺傳疾病風險的夫婦,對體外受精(in-vitro fertilization,IVF)胚胎進行活檢,采用多種技術進行遺傳學診斷,以選擇
2、正常胚胎進行移植,提高臨床妊娠率和臨床分娩率,降低流產(chǎn)率,是輔助生殖技術與分子生物學技術相結(jié)合而形成的一種產(chǎn)前診斷技術。PGS是對植入前的胚胎進行染色體非整倍進行檢測,目前所用的 PGD/PGS技術有聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR),熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH),全基因組擴增技術(whole genome amplificatio
3、n,WGA),比較基因組雜交芯片(comparative genomic hybridization arrays,aCGH),單核苷酸多態(tài)性芯片(single nucleotide polymorphism arrays,SNP),二代測序技術(next-generation sequencing technology,NGS)等。
WGA是一種能對微量甚至是極微量DNA進行有效擴增的技術,其擴增產(chǎn)物可被多種常規(guī)分子技術用于
4、下游的遺傳學分析。盡管現(xiàn)有多種被優(yōu)化的 WGA技術,但本質(zhì)上都可歸于擴增前引物延伸反應(Primer extension preamplification,PEP)、簡并寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligonucleotide primer PCR,DOP-PCR)和多重置換擴增(Multipledis- placement amplification,MDA)[1]這三種方法。WGA技術已在臨床廣泛應用,如循環(huán)腫瘤細胞
5、的基因分型[2],法醫(yī)樣本的鑒定,PGD/PGS胚胎的染色體和單基因病的基因分析等。通過ART所獲得的胚胎發(fā)生染色體異常的可能性較高,這是導致胚胎植入失敗、孕早期胎停育及自發(fā)性流產(chǎn)的重要原因。在PGD/PGS領域,aCGH和SNP芯片因能夠檢測胚胎24條染色體且具有較高的可靠性和準確性,而被廣泛應用于鑒別整倍體與非整倍體胚胎[3,4]。無論是芯片技術還是 NGS平臺,都依賴于WGA技術這一關鍵步驟將胚胎活檢樣本的微量DNA高保真擴增,產(chǎn)
6、生的足量DNA能夠用于芯片的雜交或NGS的建庫。關于WGA技術在PGD/PGS領域的應用多有研究,但是基于現(xiàn)有NGS平臺,針對于不同WGA技術在PGD/PGS領域應用的橫向研究未見報道。
在PGD/PGS的臨床實踐中,aCGH和SNP芯片在染色體異常的檢測方面顯現(xiàn)出較高的可靠性和準確性。但是,現(xiàn)有的商業(yè)化的芯片平臺在探針設計、探針定制以及染色體探針密度分布方面存在顯著不同,此外,某些平臺因檢測分辨率較低難以檢測出具有顯著臨床意
7、義的IVF胚胎染色體異常。另外,SNP芯片在檢測染色體三體和其它由于未減數(shù)分裂重組導致的染色體重復方面也存在不足。在臨床實踐中,從胚胎樣本活檢到出具檢測報告,芯片平臺工作流程繁瑣,且需對 DNA進行標記、雜交。因芯片及相關試劑費用高昂,探針數(shù)量有限等客觀因素,致使芯片檢測效率較低。而NGS結(jié)合強有效的生物信息學算法,使對IVF胚胎染色體異常的檢測更加全面且更加經(jīng)濟有效,為PGD/PGS領域的發(fā)展帶來新機遇。
我們將NGS技術與
8、生物信息學聯(lián)合應用開發(fā)出適用于單細胞PGS分析的高分辨率拷貝數(shù)變異測序技術(Copy number variation sequencing,CNV-Seq),以解決胚胎活檢樣本的CNV檢測問題,同時將基于PCR的SurePlex WGA方法引入現(xiàn)有PGS流程,評估其檢測染色體異常的效能,使CNV-Seq的臨床轉(zhuǎn)化應用成為可能,并有望取代aCGH及 SNP芯片在PGS領域的應用,對胚胎染色體異常進行精準檢測。
目的:
9、 1.依托所研發(fā)的CNV-Seq技術平臺,對三種WGA方法——以PCR為基礎的SurePlex和MALBAC與以MDA為基礎的REPLI-g,從擴增覆蓋度、敏感性、特異性和可重復性等方面進行對比研究。希望通過我們的研究,將具有擴增優(yōu)勢的WGA方法引入現(xiàn)有的測序流程。
2.分別用回顧性研究和雙盲研究,以 aCGH為金標準,利用 CNV-Seq檢測染色體非整倍性和非平衡易位,全面評估其檢測染色體異常的效能,并進一步將CNV-Seq
10、技術臨床轉(zhuǎn)化應用至PGS領域。
方法:
1.選取6名具有臨床表型的染色體疾病患者為研究對象,1名正常核型的男性為陰性對照,收集研究對象的外周血,提取基因組DNA(genomic DNA,gDNA),純化后梯度稀釋至15pg,顯微操作從患者的凍融外周血中分離單細胞,分別在稀釋gDNA單細胞水平和單細胞水平,對SurePlex、MALBAC和REPLI-g三種WGA方法全基因組覆蓋度、敏感性、特異性和可重復性等方面進行對
11、比研究。
2.選取24例經(jīng)aCGH檢測的WGA產(chǎn)物,其中10例WGA產(chǎn)物用于回顧性研究,14例WGA產(chǎn)物用于雙盲研究,我們以aCGH為金標準,驗證CNV-Seq在檢測染色體非整倍體和非平衡易位方面的效能,通過直接比較aCGH和CNV-Seq對同一例胚胎單卵裂球活檢的WGA產(chǎn)物的檢測結(jié)果,來驗證CNV-Seq的檢測效能。選擇3對需行PGS檢測的夫婦進行初步的臨床轉(zhuǎn)化。
結(jié)果:
1.從技術方法、產(chǎn)量、濃度、平均
12、擴增產(chǎn)物長度、所需時間、操作難易程度等方面對SurePlex、MALBAC和REPLI-g這三種WGA方法進行了比較,SurePlex和MALBAC在可操作性上確有一定優(yōu)勢。
2. SurePlex和MALBAC這兩種基于PCR的WGA方法較MDA具有更好的基因組覆蓋度、較少的擴增偏倚。
3.針對于低起始模板量的DNA,無論是15pg gDNA還是單細胞,基于PCR的WGA方法在擴增覆蓋度、穩(wěn)定性、敏感性、特異性和可
13、重復性等方面均優(yōu)于不依賴PCR的MDA技術。
4.回顧性研究和雙盲研究驗證了CNV-Seq在檢測染色體非整倍體和非平衡易位方面的效能,結(jié)果證實CNV-Seq在對染色體CNV的檢測方面具有高準確率和特異性。
5. CNV-Seq初步實現(xiàn)其臨床轉(zhuǎn)化應用,已成功在3對不孕不育夫婦實施,其中一對夫婦在選擇染色體整倍體胚胎植入后分娩一健康女嬰,使不孕不育患者真正受益。
結(jié)論:
1.針對低起始模板量的DNA,
14、無論是稀釋 gDNA單細胞水平還是單細胞水平,基于PCR的SurePlex和MALBAC WGA方法在擴增覆蓋度、穩(wěn)定性、敏感性、特異性和可重復性等方面均優(yōu)于不依賴 PCR的 REPLI-g MDA技術,聯(lián)合使用CNV-Seq技術能有效對臨床病理性CNVs做出診斷。
2. CNV-Seq在對染色體CNV的檢測方面具有高準確率和特異性,隨著NGS技術的迅速發(fā)展,其有望取代aCGH及SNP芯片在PGS領域的應用,對胚胎染色體異常進
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