鳥苷產(chǎn)生菌Bacillus subtilis JSIM-G518的改良及其發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、鳥嘌呤核苷(guanosine，鳥苷)商品名稱為GR，又名9-13-D-呋喃核糖基鳥嘌呤。其用途十分廣泛，是食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的重要中間體，可用于合成食品增鮮劑5'-鳥苷酸二鈉、呈味核苷酸二鈉和核苷類抗病毒藥物如利巴韋林、阿昔洛韋等，也是用于制造三磷酸鳥苷鈉等藥物的主要原料。隨著越來越多的企業(yè)進入生產(chǎn)利巴韋林、阿昔洛韋和5'-鳥苷酸的行列，國內(nèi)鳥苷市場需求量激增。本論文以提高鳥苷產(chǎn)量為目標(biāo)，通過對已分離菌株Bacillus subtilis

2、 JSIM-G518進行原生質(zhì)體紫外誘變，分離得到一株產(chǎn)量較高的突變菌株JSIM-GU-124-19，然后對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化以進一步提高鳥苷產(chǎn)量，并對鳥苷補料發(fā)酵和調(diào)控進行了初步研究。其主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.通過對酶解濃度、酶解溫度的實驗分析，確定了JSIM-G518原生質(zhì)體形成率與再生率較高的最佳條件：溶菌酶終濃度控制在2.4 mg/mL，酶解溫度36℃的水浴中處理40 min。對JSIM-G518原生質(zhì)體直接進行紫外誘變處

3、理，方法簡單、效果好，能在較短時間內(nèi)較大幅度提高菌種的生產(chǎn)能力、改善菌種性能。本實驗的出發(fā)菌株JSIM-G518并未缺失核苷水解酶，所以紙電泳測定鳥苷含量時混有了鳥嘌呤，使得鳥苷實際產(chǎn)量降低。為了進一步提高該菌株的生產(chǎn)性能，本實驗以原生質(zhì)體的紫外誘變方式，獲得了核苷水解酶缺失的突變菌株，阻止了鳥苷代謝為鳥嘌呤，并進一步獲得了磺胺胍，狹霉素C的抗性突變株，解除了終產(chǎn)物的抑制和阻遏，使鳥苷產(chǎn)量達(dá)到24.0 g/L。 2.采用單因素優(yōu)化方法對

4、鳥苷發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行了一系列的研究，并在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面實驗方法對發(fā)酵培養(yǎng)基中最主要的三種影響因素葡萄糖、酵母粉、豆餅水解液進行了進一步的優(yōu)化。建立了鳥苷發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵條件：發(fā)酵最適pH值為6.4，最適發(fā)酵溫度為36℃，溶氧控制在40％，并于種子生長時間10 h時轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵。確立了鳥苷的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖12.5％，酵母粉1.4％，(NH4)2SO4 1.5％，MgSO4 0.5％，KH2PO4 0.4

5、％，谷氨酸鈉1.0％，CaCl2 0.2％，豆餅水解液4.0 mL/dL，玉米漿1.7 mL/dL，CaCO3 2.0％。優(yōu)化后鳥苷的最高發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)到28.3 g/L。 3.通過對鳥苷補料發(fā)酵和調(diào)控的研究，確立了谷氨酸鈉和二噁烷的最佳流加方式和濃度。實驗表明，分批加入總量為0.25％的谷氨酸鈉較起始時一次性加入1.0％的谷氨酸鈉，鳥苷產(chǎn)量沒有影響，降低了生產(chǎn)原料成本。在發(fā)酵30 h加入終濃度為100 mg/L的二噁烷，縮短了發(fā)酵周期，