膠原蛋白肽生物功能材料的研究與開發(fā).pdf

1、近年來隨著生物醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)的突破性研究發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了膠原蛋白肽在人體內(nèi)有重要作用，其中，最具里程碑意義的是發(fā)現(xiàn)膠原蛋白肽有著自己的特征和性能。本論文將復(fù)合酶降解的膠原蛋白肽為研究方向，試圖建立一套系統(tǒng)的研究方案：對膠原蛋白肽的復(fù)合酶提取工藝、分離純化、檢測技術(shù)以及相關(guān)理論進行探討：并對氨基酸序列和三維立體結(jié)構(gòu)特點以及膠原蛋白肽的一些功能和性質(zhì)進行分析和研究；同時，對金屬肽的合成和膠原蛋白肽的應(yīng)用進行了初步探索。 用復(fù)合酶去酶解皮

2、革下腳料鉻革屑，利用酸性蛋白酶3350、堿性蛋白酶2709、中性蛋白酶AS1.398、Protamex、Flavourzyme等水解皮革，提取其中的膠原蛋白肽。選擇和影響酶作用的各種影響因素表明：先用CaO進行前處理，再用堿性蛋白酶2709和中性蛋白酶AS1.398的協(xié)同作用進行酶解，將水解液進行過濾后，脫鉻并濃縮干燥是一條有效的工藝途徑。產(chǎn)物的檢驗結(jié)果證實：粗蛋白含量≥90％。研究還提出了用阿貝折射儀測定溶液折射率來控制水解程度，并從

3、原理上對其可行性進行了論證，試驗結(jié)果給予了證實。 用上述產(chǎn)物——水解膠原蛋白肽作為合成肽銅的原料，研究得到的工藝條件為：反應(yīng)液pH=11，常溫反應(yīng)20 min；紅外光譜法鑒定了目標產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的正確性；X-衍射和核磁技術(shù)對金屬肽進行了測定，并表征了其三維空間結(jié)構(gòu)。 設(shè)計了毛細管層析質(zhì)譜法結(jié)合等電點聚焦法以及數(shù)據(jù)庫搜尋蛋白質(zhì)組的聯(lián)機設(shè)備，即多維分離鑒定技術(shù)，使得研究工作簡單易行。設(shè)備所使用的樣品及緩沖溶液用量可微型化，樣品量減

4、少到100μL以下，緩沖液的用量僅為5～10mL，此項技術(shù)更有利于生化樣品快速準確的檢測。 對分離純化后的膠原蛋白肽進行了序列測定和空間立體結(jié)構(gòu)的表征。用現(xiàn)代分析手段對膠原蛋白肽三維立體圖譜、片斷圖譜和氨基酸組成以及結(jié)構(gòu)等進行了測定和研究。直觀地觀察了氨基酸的傾向結(jié)構(gòu)和底部結(jié)構(gòu)、卡通環(huán)和主骨架、二級結(jié)構(gòu)和末端、金屬化合物的配體結(jié)構(gòu)、膠原肽的晶體結(jié)構(gòu)、水合結(jié)構(gòu)以及多聚體結(jié)構(gòu)等。 對膠原蛋白肽的功能和性質(zhì)進行了研究和討論。在

5、膠原蛋白肽中引入硫醇基，使二硫鍵控制溶解肽在DBC中的活動成為可能。DBC-溶解肽共軛體證實了溶解肽的活性；其在制備后至少3個月內(nèi)穩(wěn)定；受pH值變化的影響，其活性在熱處理后比自由酶穩(wěn)定；pH=6.3時，活性最強，而天然溶解肽的pH=9.0。 研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白肽濃度大于0.5mg·mL<'-1>時，在465nm處的熒光強度有突躍：繼續(xù)增大濃度，熒光強度越來越大。當膠原蛋白肽濃度增大并超過0.15mg·mL<'-1>時，體系具有較

6、高的粘度，進一步證實了膠原蛋白肽在水溶液中的聚集特性。 采用高效液相色譜法，優(yōu)化流動相的組成，成功地將16種目標肽與其它雜質(zhì)分離。同時成功地分析了結(jié)構(gòu)相似的小分子肽。以三氟乙酸為流動相和酸性調(diào)節(jié)劑，考察乙腈一水不同配比對肽分離的影響，流動相乙腈含量在2096和流速在1.0 mL·min<'-1>，可達到分離的目的。目標肽純度范圍23.7896～89.90％，保留時間3.35～27.15min。胰島素A鏈和胰島素B鏈標準品測定結(jié)果

7、為：主峰純度分別為79.98％和87.69％，而產(chǎn)品的標示純度為80.11％和89.3496，這表明本方法的分離效率較好。 建立了一種有效分離小分子肽的Tricine-SDS-PAGE的方法。調(diào)整膠中聚丙烯酰胺膠的組成，讓致密膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的交聯(lián)度為5.5％，并加入38％的尿素，可以有效地分離≤1kD的肽鏈，此方法明顯優(yōu)于常規(guī)的SDS-PAGE和現(xiàn)有的Tricine-SDS-PAGE方法。 毛細管電泳—十二烷基

8、硫酸鈉(CE-SDS)蛋白設(shè)備用于亞膠原蛋白肽的動力學(xué)篩選分離。最佳條件為：使用36cm(或24cm)×50um的無涂層毛細管，電泳注射電壓為10kV/10s，操作電壓15kV，毛細管溫度20℃。在220nm處紫外檢測，發(fā)現(xiàn)此方法有很好的重現(xiàn)性，且實驗數(shù)據(jù)均呈線性關(guān)系。膠原蛋白肽的動力學(xué)篩選毛細管電泳(DSCE)圖在數(shù)值上、相關(guān)含量上與用庫馬西著色的SDS-PAGE凝膠掃描結(jié)果相似。 本項目的產(chǎn)品經(jīng)分析檢測，富含19種氨基酸，蛋