重組大腸桿菌工業(yè)生產(chǎn)三種蛋白藥物過程中的關(guān)鍵技術(shù).pdf

1、本文圍繞如何在大腸桿菌中生產(chǎn)藥用蛋白的關(guān)鍵技術(shù)問題包括目的蛋白的高效表達(dá)、包涵體蛋白的復(fù)性、蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離純化以及蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性提高等開展研究，并以處于不同開發(fā)階段的三個(gè)重組蛋白藥物為研究對(duì)象，發(fā)展了滿足實(shí)驗(yàn)室階段、中試生產(chǎn)和已有成熟市場(chǎng)等特定時(shí)期迫切需要解決問題的關(guān)鍵技術(shù)。
　　促紅細(xì)胞生成素模擬肽(EMP1)是一種由20個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，氨基酸序列與EPO不存在同源性但其生物功能與EPO基本相同。本文首先通過二種不同

2、的連接肽將兩分子的EMP1串聯(lián)構(gòu)成了二串體，代替化學(xué)法的二聚體，然后與硫氧還蛋白或DsbA等融合在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了可溶性高效表達(dá)。在最優(yōu)誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度下，二串體融合蛋白的可溶性表達(dá)水平可達(dá)到0.83g/L，并可采用金屬螯合層析和疏水作用層析獲得較高純度的目標(biāo)融合蛋白，純化收率約為6.3～7.8％。融合蛋白再經(jīng)過腸激酶切割和反相作用層析可以獲得EMP1二串體，兩種不同長(zhǎng)度連接肽的EMP1二串體與EMP1單體相比，生物活性提高了10

3、倍，連接肽的長(zhǎng)短對(duì)活性沒有顯著影響。
　　重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)由114個(gè)氨基酸組成，其生物活性形式為同源二聚體或與BMP-7形成異二聚體，由于極強(qiáng)的疏水性，在大腸桿菌中包涵體形式表達(dá)的BMP-2復(fù)性率低下而且成本高，后分離困難。本文系統(tǒng)地研究了表達(dá)后處理包括包涵體的溶解條件和不同復(fù)性液組成對(duì)復(fù)性的影響，發(fā)現(xiàn)鹽酸胍體系溶解包涵體更有效，目標(biāo)蛋白回收率也更高。通過篩選獲得了最佳復(fù)性液組成，建立了操作簡(jiǎn)便的可放大的稀

4、釋法復(fù)性方案，最佳條件下的復(fù)性率大于70％，復(fù)性液成本大大下降，復(fù)性液不需任何預(yù)處理就可以直接進(jìn)行后續(xù)純化。開發(fā)了新穎的利用疏水作用層析原理的純化方法，篩選出N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作為添加劑并優(yōu)化了添加濃度，發(fā)現(xiàn)5％的DMF具有最好的分離度;通過不同鹽濃度下的操作模式的比較，建立了兩步法、DMF輔助的疏水作用層析分離工藝，最后分離達(dá)到的rhBMP-2同二聚體不僅純度高，而且生物活性與商業(yè)化的CHO細(xì)胞來源的rhBMP-2相比AL

5、P活力相當(dāng)，與Wyeth公司的rhBMP-2制劑INDUCTOSTM相比異位成骨活性更高，平均收率達(dá)到每克包涵體濕重產(chǎn)出80mg rhBMP-2同二聚體。DMF可以通過透析和凍干從rhBMP-2產(chǎn)品中完全去除，殘留量未檢出。這一套有效的復(fù)性和純化工藝在中試生產(chǎn)車間進(jìn)行了放大驗(yàn)證。另外，還針對(duì)大腸桿菌來源的rhBMP-2產(chǎn)品初步建立了反相高效液相色譜法和分子篩高效液相色譜法的純度測(cè)定方案，并與毛細(xì)管電泳法和SDS-PAGE電泳法進(jìn)行相互驗(yàn)

6、證。
　　重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)是一類重要的已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的細(xì)胞因子類重組蛋白藥物，如何提升該產(chǎn)品的穩(wěn)定性和質(zhì)量水平具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文建立了可靠的基于C4柱的反相HPLC純度測(cè)定方法，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，分離度大于現(xiàn)有藥典標(biāo)準(zhǔn)方法;通過37℃加速和4℃長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)研究了生產(chǎn)過程三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響，篩選了來自不同廠家的三類常見藥品包材-安瓿瓶、西林瓶和預(yù)裝針，通過制劑工藝條件的優(yōu)化、確立和新處