基于納-微米多級(jí)孔結(jié)構(gòu)或寡肽修飾的聚乳酸類組織工程支架：構(gòu)建及對(duì)細(xì)胞作用研究.pdf

1、組織工程(Tissue Engineering)概念自20世紀(jì)80年代提出以來(lái)得到了迅速的發(fā)展，其基本原理和方法是：將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的正常組織細(xì)胞吸附于一種生物相容性良好并可被機(jī)體吸收的生物材料上形成復(fù)合物，將細(xì)胞—生物材料復(fù)合物植入機(jī)體組織或器官病損部位，細(xì)胞在生物材料逐漸被機(jī)體降解吸收的過(guò)程中形成新的具有形態(tài)和功能的相應(yīng)組織、器官，達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。采用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建人工組織或器官，給急需組織修復(fù)和器官移植的病人帶來(lái)

2、了曙光。利用生物材料構(gòu)建的三維支架為細(xì)胞生長(zhǎng)和功能化提供人工細(xì)胞外基質(zhì)和三維支撐。同時(shí)支架材料還能做為模板引導(dǎo)組織生長(zhǎng)和整合，提供特殊的生物活性信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化和維持細(xì)胞功能。因此在為組織形成構(gòu)建特定環(huán)境時(shí)支架材料的選擇及其物理和化學(xué)性質(zhì)是關(guān)鍵。最近組織工程研究的重要趨勢(shì)是設(shè)計(jì)和制備在結(jié)構(gòu)和功能上仿生的支架材料，通過(guò)在支架中引入物理或/和化學(xué)生物信號(hào)獲得特異性細(xì)胞反應(yīng)，達(dá)到引導(dǎo)組織再生的目的。 因此，本論文研究首先構(gòu)建具有

3、納米/微米多級(jí)孔結(jié)構(gòu)的聚乳酸類三維支架，模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)中膠原的顯微結(jié)構(gòu)——納米或亞微米纖維網(wǎng)絡(luò)，采用相分離技術(shù)構(gòu)建出系列具有微米多通道、微米孔徑和納米纖維的聚乳酸類組織工程支架，研究了支架微結(jié)構(gòu)與細(xì)胞之間的相互作用。在此基礎(chǔ)上，利用靜電紡絲技術(shù)制備具有不同拓?fù)湫蚊驳募{米纖維；合成出一種含端功能基團(tuán)的PLLA，通過(guò)化學(xué)方式鍵合兩種層粘連蛋白衍生短肽。然后在2D支架中考察了它們?cè)诖龠M(jìn)神經(jīng)細(xì)胞粘附和軸突長(zhǎng)出的作用，為進(jìn)一步仿生制備同時(shí)具有

4、生物學(xué)信息和物理誘導(dǎo)功能的組織工程支架提供科學(xué)依據(jù)。具體如下： 一、具有多縱向排列通道、多級(jí)孔結(jié)構(gòu)的PLGA導(dǎo)管的制備及在脊髓損傷修復(fù)中應(yīng)用研究 神經(jīng)導(dǎo)管可為神經(jīng)修復(fù)提供一個(gè)合適的微環(huán)境，使得神經(jīng)纖維能夠再生并順利到達(dá)遠(yuǎn)端。在本章節(jié)研究中我們采用熱誘導(dǎo)相分離和低溫注射成型相結(jié)合的技術(shù)制備出具有可控多縱向排列通道、大孔/微孔多級(jí)結(jié)構(gòu)的PLGA神經(jīng)導(dǎo)管。神經(jīng)導(dǎo)管的外徑及內(nèi)部通道的數(shù)目和內(nèi)徑可以通過(guò)改變模具結(jié)構(gòu)控制，通道之間壁

5、的多孔結(jié)構(gòu)可以通過(guò)調(diào)節(jié)PLGA溶液濃度和進(jìn)一步加入致孔劑控制。體外降解實(shí)驗(yàn)顯示7通道神經(jīng)導(dǎo)管在37℃ PBS緩沖溶液中能夠保持外形12周，降解液pH值維持在4.1-4.5之間。大鼠脊髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat MSCs)單獨(dú)培養(yǎng)或者與大鼠雪旺細(xì)胞(rat SCs)共培養(yǎng)時(shí)能夠在神經(jīng)導(dǎo)管中很好的黏附、伸展和增殖，顯示出神經(jīng)導(dǎo)管具有良好的細(xì)胞相容性。PLGA神經(jīng)導(dǎo)管體內(nèi)移植到大鼠脊髓能夠很好的與宿主結(jié)合，沒(méi)有發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)，并且有宿主細(xì)胞向

6、導(dǎo)管內(nèi)遷移，結(jié)果顯示導(dǎo)管在大鼠脊髓組織內(nèi)具有良好的相容性。因此本章節(jié)研究中所制備的PLGA多縱向排列通道、多級(jí)孔結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管在脊髓損傷修復(fù)中具有潛在的應(yīng)用前景。 二、具有納米纖維結(jié)構(gòu)的PCL—b—PLLA(50/50)三維多孔支架的制備與性能研究 采用液—液相分離和鹽瀝濾相結(jié)合的技術(shù)制備出PCL—b—PLLA三維多孔納米纖維支架，支架大孔孔徑為144±36μm，孔壁由直徑為151±56 nm的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成。DSC結(jié)

7、果顯示嵌段共聚物PCL—b—PLLA為半晶質(zhì)聚合物，PCL鏈段和PLA鏈段在體系凝膠化過(guò)程中分別結(jié)晶但相互又有一定的干擾。低溫條件下易于凝膠化形成結(jié)晶微區(qū)，濾出溶劑冷凍干燥后即得到納米纖維結(jié)構(gòu)。納米纖維的形貌與凝膠化溫度相關(guān)，當(dāng)5％(W/V) PCL—b—PLLA/THF溶液在—20℃和—40℃凝膠化時(shí)能夠形成均勻的納米纖維網(wǎng)絡(luò)，而在4℃凝膠化時(shí)在納米纖維網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)片狀節(jié)點(diǎn)，升高凝膠化溫度會(huì)增大片狀結(jié)構(gòu)面積進(jìn)而形成連續(xù)結(jié)構(gòu)。這主要是因?yàn)?/p>

8、PCL鏈段在THF溶液中的凝膠化溫度較低，以及PCL分子鏈重排受到PLA剛性段的干擾而致使結(jié)晶度下降，無(wú)定型部分比例升高。與平滑的實(shí)體孔壁相比，納米纖維結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，納米纖維支架上軟骨細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量和DNA含量分別是平滑實(shí)體孔壁支架上的1.3-1.4和1.2-1.4倍。研究結(jié)果表明這種具有多孔和納米纖維結(jié)構(gòu)的PCL—b—PLLA三維支架在軟骨組織工程中具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。 三、改進(jìn)相分離技術(shù)制備具

9、有可控孔結(jié)構(gòu)的PLLA納米纖維支架 單獨(dú)以THF為溶劑制備的納米纖維支架中微孔孔徑在10μm以下，大大限制了該技術(shù)在組織工程中的應(yīng)用。在本章節(jié)研究中我們以二氧六環(huán)/水為共溶劑，制備出同時(shí)具有大孔/微孔和納米纖維結(jié)構(gòu)的PLLA三維支架。支架中大孔孔徑主要由相分離過(guò)程中粗化因素決定，而納米纖維網(wǎng)絡(luò)的形成則是由凝膠化過(guò)程中PLLA結(jié)晶引起。凝膠化溫度和雙組分溶劑比例是影響支架形貌的兩個(gè)重要因素。當(dāng)凝膠化溫度為12℃，水含量分別為10％

10、和12％時(shí)，支架中微孔直徑為50±25μm，孔壁由纖維直徑在50-200 nm之間的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成。升高凝膠化溫度或者增加水在雙組分溶劑中含量，支架孔徑增加，甚至?xí)a(chǎn)生直徑達(dá)300μm的大孔。但是當(dāng)凝膠化溫度高于12℃或水含量超過(guò)12％時(shí)，觀察到尺寸在微米級(jí)的片狀結(jié)構(gòu)而非納米纖維網(wǎng)絡(luò)。DSC分析結(jié)果顯示PLLA納米纖維支架材料的結(jié)晶度隨凝膠化溫度升高和水含量增加而升高，XRD結(jié)果進(jìn)一步顯示納米纖維結(jié)構(gòu)中PLLA主要表現(xiàn)為α'晶型，而片

11、狀結(jié)構(gòu)所對(duì)應(yīng)的晶型主要為α型。SEM和MTT檢測(cè)結(jié)果顯示納米纖維支架為大鼠脊髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat MSCs)黏附、伸展和增殖提供了一個(gè)比片狀結(jié)構(gòu)支架更好的環(huán)境。 四、具有不同拓?fù)湫蚊驳腜LLA靜電紡絲納米纖維的制備及對(duì)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響 納米纖維能夠模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了一個(gè)良好的環(huán)境。然而細(xì)胞—納米纖維作用以及納米纖維拓?fù)湫蚊怖缰睆胶腿∠驅(qū)?xì)胞生長(zhǎng)和功能的影響在以往研究中卻

12、很少涉及，而細(xì)胞—材料作用在組織工程支架研究中具有重要的指導(dǎo)意義。在本章節(jié)中我們采用靜電紡絲技術(shù)制備了一系列具有不同取向和不同纖維直徑的PLLA纖維支架?？v向排列纖維的直徑在307±47 nm～917±84 nm之間，無(wú)規(guī)分布纖維的直徑在327±40 nm～1150±109 nm之間。纖維的直徑受各種因素影響，包括聚合物濃度、溶劑、電壓以及環(huán)境溫度和濕度。新生小鼠小腦C17.2干細(xì)胞在PLLA纖維上的活性和增殖不但受纖維直徑的影響而且也

13、受到纖維支架的孔徑影響。較小直徑的纖維能夠吸附更多的營(yíng)養(yǎng)因子因而能促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖，但太小的纖維直徑會(huì)產(chǎn)生較小的孔徑反而抑制細(xì)胞在纖維支架上滲透。纖維縱向排列時(shí)能夠引導(dǎo)細(xì)胞沿著纖維長(zhǎng)軸方向生長(zhǎng)和伸展，最后形成極化和拉長(zhǎng)的胞體。而在無(wú)規(guī)分布纖維上的細(xì)胞則呈現(xiàn)出無(wú)規(guī)分布的梭形或者多角形。與無(wú)規(guī)分布纖維相比，纖維縱向排列時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞長(zhǎng)出更長(zhǎng)的神經(jīng)軸突，突顯其接觸引導(dǎo)效應(yīng)。因此我們的研究為纖維支架的設(shè)計(jì)和制備提供了重要的參考價(jià)值。 五

14、、兩種層粘連蛋白衍生短肽序列修飾改性PLLA及對(duì)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化影響 大量可降解吸收的聚酯類高分子已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物載體，但是由于缺乏功能基團(tuán)，不能連接生物活性分子，其應(yīng)用也受到限制。在本章節(jié)中，首先合成賴氨酸封端的PLLA[K—(CH2)n—PLLA(n=2，5，8)]，通過(guò)改變賴氨酸與PLLA主鏈亞甲基數(shù)目調(diào)節(jié)連接末端氨基的臂長(zhǎng)；然后將K—(CH2)n—PLLA與PLLA(10/90，W/W)復(fù)合澆注

15、成膜，采用極性水溶劑誘導(dǎo)聚合物中氨基向膜表面聚集。原子力顯微鏡觀察結(jié)果顯示復(fù)合膜與純PLLA膜相比表面粗糙度增加，由于K—(CH2)n—PLLA分子鏈末端氨基和PLLA主鏈骨架親水性的差異，復(fù)合膜表面出現(xiàn)微相分離現(xiàn)象。增加PLLA主鏈與賴氨酸的連接臂長(zhǎng)、延長(zhǎng)水誘導(dǎo)時(shí)間可以進(jìn)一步增加膜的粗糙度，促進(jìn)微相分離。利用雙偶聯(lián)劑Sulfo—SMCC將存在于層粘連蛋白中的兩個(gè)短肽序列CYIGSR(Cys—Tyr—Ile—Gly—Ser—Arg)和C

16、SIKVAV(Cys—Ser—Ile—Lys—Val—Ala—Val)與復(fù)合膜表面氨基鍵合，實(shí)現(xiàn)了短肽修飾PLLA的目的。與純PLLA膜相比，短肽修飾復(fù)合膜能夠提高新生小鼠小腦C17.2細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞長(zhǎng)出更長(zhǎng)的神經(jīng)軸突，當(dāng)連接臂長(zhǎng)為5個(gè)亞甲基時(shí)(對(duì)應(yīng)于K—(CH2)5-PLLA/PLLA)，復(fù)合膜表面短肽密度達(dá)最大值(0.28±0.03μg/c㎡)，短肽對(duì)C17.2細(xì)胞的粘附和軸突長(zhǎng)出的促進(jìn)作用最為顯著。因此本章節(jié)的研究建立了一種