Acidithiobacillus ferrooxidans對(duì)酸脅迫與有機(jī)萃取物P204脅迫應(yīng)答及其機(jī)理研究.pdf

1、Acidithiobacillus ferrooxidans(A.ferrooxidans)是生物冶金過(guò)程中的典型菌株，在實(shí)際的工業(yè)應(yīng)用中，生物冶金細(xì)菌群落常常處于非適宜的環(huán)境中，如環(huán)境酸度過(guò)高或是受到有機(jī)萃取物的脅迫，給細(xì)菌正常的代謝與功能帶來(lái)一定脅迫。生物冶金過(guò)程中，細(xì)菌保持正常生理活動(dòng)是十分關(guān)鍵的一環(huán)。因此，研究工業(yè)常見(jiàn)的過(guò)酸環(huán)境下以及有機(jī)萃取劑脅迫下浸礦微生物的特性具有重大意義。本研究中選用浸礦典型菌株A.ferrooxidan

2、s進(jìn)行研究，鑒于自養(yǎng)菌A.ferrooxidans與異養(yǎng)菌Acidiphilum Acidophilum(Aph.acidophilum)常共同生長(zhǎng)，并有報(bào)道稱在以亞鐵為能源物質(zhì)情況下之間存在某種協(xié)同生長(zhǎng)機(jī)制，并輔以A.ferrooxidans與Aph.acidophilum的共培養(yǎng)浸礦微生物體系進(jìn)行研究。
　　 本文應(yīng)用基因芯片技術(shù)從基因表達(dá)層面全面剖析A.ferrooxidans在酸脅迫下的抗性機(jī)制。研究表明A.ferroo

3、xidans對(duì)無(wú)機(jī)酸的耐受過(guò)程主要涉及四個(gè)層次，即細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、物質(zhì)與能量代謝、調(diào)節(jié)功能:通過(guò)誘導(dǎo)Omp85(細(xì)胞膜中插入蛋白和脂質(zhì)的必要組件)控制細(xì)胞膜成分變化，從細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化以適應(yīng)或抵抗酸脅迫帶來(lái)的負(fù)面影響;通過(guò)上調(diào)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(plasma-membraneproton-efflux P-type ATPase/質(zhì)膜質(zhì)子外排P型ATP酶，AFE0818)，并下調(diào)ATP合酶、鉀離子和氨離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白控制質(zhì)子的內(nèi)流

4、;誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)于胞內(nèi)pH緩沖的部分基因如，堿性化合物通道蛋白(carbonic anhydrase/碳酸酐酶)以中和胞內(nèi)多余質(zhì)子以達(dá)到緩沖pH目的;強(qiáng)烈誘導(dǎo)抗壓轉(zhuǎn)錄因子RpoS的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)相關(guān)抵抗環(huán)境壓力的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄控制水平的調(diào)節(jié)。
　　 對(duì)于A.ferrooxidans與Aph.acidophilum的共培養(yǎng)浸礦微生物體系，在以硫?yàn)槟茉次镔|(zhì)的條件下，生長(zhǎng)前期A.ferrooxidans占生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，但當(dāng)達(dá)到A.fe

5、rrooxidans的穩(wěn)定期時(shí)Aph.acidophilum快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期且菌數(shù)超出了A.ferrooxidans，之后A.ferrooxidans迅速進(jìn)入生長(zhǎng)后期衰亡期，至此Aph.acidophilum成為此體系中的優(yōu)勢(shì)菌種。故而推斷出在以硫?yàn)槟茉次镔|(zhì)的條件下Aph.acidophilum的生長(zhǎng)依賴于A.ferrooxidans，然而Aph.acidophilum的快速生長(zhǎng)會(huì)對(duì)A.ferrooxidans的生長(zhǎng)帶來(lái)負(fù)面的影響。

6、>　　 受到有機(jī)酸萃取劑P204的刺激下，本研究中利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)探究了A.ferrooxidans中相關(guān)基因的表達(dá)差異，在A.ferrooxidans單獨(dú)培養(yǎng)條件下以及與Aph.acidophilum的共培養(yǎng)條件下體現(xiàn)出不同的抗性。在A.ferrooxidans單獨(dú)培養(yǎng)條件下受到有機(jī)酸P204脅迫時(shí)，根據(jù)能表現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的指標(biāo)RpoS的表達(dá)情況，即呈現(xiàn)隨脅迫時(shí)間增加而被誘導(dǎo)的趨勢(shì)，且其他相關(guān)抗性機(jī)制基因的表達(dá)情況相類似如

7、細(xì)胞膜脂雙層上形成離子通道的Omp40、與細(xì)胞膜的磷脂層合成有關(guān)Phosphoheptose isomerase/cytidylyltransferase(磷酸庚糖異構(gòu)酶/胞苷酰轉(zhuǎn)移酶)、負(fù)責(zé)切斷C-P鍵的磷酸酶亞基PhnL和PhnK以及Universal stress family protein(應(yīng)激家族蛋白:AFE2259，AFE2183，AFE2133)，可以推斷A.ferrooxidans在有機(jī)酸P204脅迫下能夠啟動(dòng)相關(guān)積極

8、反應(yīng)機(jī)制應(yīng)對(duì)外界脅迫，但此反應(yīng)只在A.ferrooxidans被脅迫一段時(shí)間后被激發(fā)(約10至20分鐘)。
　　 在A.ferrooxidans與Aph.acidophilum的共培養(yǎng)條件下，根據(jù)能表現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的指標(biāo)RpoS的表達(dá)情況(受到脅迫10分鐘時(shí)被誘導(dǎo)而后脅迫持續(xù)至20分鐘又下調(diào))，以及其他相關(guān)基因在共培養(yǎng)條件下中的表達(dá)情況(其他兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子除RpoE在脅迫5分鐘被輕微誘導(dǎo)外都未有顯著的表達(dá)變化，RpoE、Uni

9、versal stress familyprotein(應(yīng)激家族蛋白，AFE2183)和PhnK在共培養(yǎng)條件下被脅迫5分鐘時(shí)被輕微誘導(dǎo)但之后都被抑制或是輕微誘導(dǎo))，并且結(jié)合共培養(yǎng)物在受到有機(jī)酸P204脅迫下的生長(zhǎng)曲線變化，即A.ferrooxidans數(shù)目迅速下降而Aph.acidophilum的快速生長(zhǎng)被抑制在一定水平，可以得出推斷A.ferrooxidans內(nèi)相關(guān)的應(yīng)對(duì)有機(jī)酸P204脅迫的積極反應(yīng)機(jī)制未被啟動(dòng)，或短時(shí)間內(nèi)A.ferr