釀酒酵母中TRAPP復合體的三個亞基在囊泡運輸和細胞自噬中的功能研究.pdf

1、囊泡運輸與細胞自噬是真核生物維持正常生命活動所必需的基本生理過程。囊泡運輸是實現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移的重要途徑，而細胞自噬則是維持細胞穩(wěn)態(tài)和應(yīng)對環(huán)境因子的脅迫所必需的一類亞細胞降解途徑。
　　 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）體內(nèi)的囊泡運輸受到Y(jié)pt/Rab類小G蛋白(GTPase)的調(diào)控，而小G蛋白的活性又受到鳥苷酸交換因子(GEFs)和GTPase激活蛋白(GAPs)的調(diào)節(jié)。釀酒酵母中的轉(zhuǎn)運蛋白顆粒(Tr

2、ansport Protein Particle，TRAPP)復合體是一類拴系因子，同時也是小G蛋白Ypt1和Ypt31/32的GEFs，可激活相應(yīng)的小G蛋白。目前酵母中已報道的TRAPP復合體有三類:TRAPPⅠ、TRAPPⅡ和TRAPPⅢ，分別在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的囊泡運輸、高爾基體內(nèi)部及離開高爾基體的運輸和細胞自噬過程中起作用。這些TRAPP復合體由六個共同的亞基(Bet3、Bet5、Trs20、Trs23、Trs31、Trs33)

3、構(gòu)成TRAPPⅠ核心復合體，在此基礎(chǔ)上，TRAPPⅡ還含有Trs120、Trs130、Trs65和Tca17四個特異性亞基，TRAPPⅢ含有Trs85特異性亞基。這些亞基中，Bet3作為共有必需亞基，在囊泡運輸中有著非常重要的作用;Trs65是一種只存在于真菌，而尚未在哺乳動物等高等真核生物中發(fā)現(xiàn)的蛋白，其主要起到組裝和穩(wěn)定TRAPPⅡ復合體的作用;而Trs85則主要作用于細胞自噬的啟動過程。已有越來越多的證據(jù)顯示小G蛋白及其GEFs除

4、了在調(diào)控囊泡運輸中發(fā)揮作用之外，也參與對細胞自噬過程的調(diào)節(jié)。但是，至今沒有研究系統(tǒng)地比較TRAPP復合體的同一亞基在囊泡運輸與細胞自噬過程中的不同功能及分析囊泡運輸與細胞自噬過程之間的關(guān)聯(lián)性。本論文將就三種具有代表性的TRAPP復合體亞基Bet3、Trs65和Trs85在囊泡運輸和細胞自噬過程中的作用開展研究并進行比較，得到如下主要結(jié)果:
　　 1.Trs65、Trs85及Bet3參與了胞內(nèi)的囊泡運輸利用四分體分離技術(shù)和直接敲除

5、法得到了trs65Δ菌株、trs85Δts菌株和trs65Δtrs85Δts菌株，并對上述菌株的胞內(nèi)Snc1蛋白所代表的囊泡運輸情況進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)豐富的條件下，TRS65敲除未引起Snc1運輸?shù)漠惓＃琓RS85敲除則引起了Snc1極性運輸功能的喪失，在胞內(nèi)呈彌散狀;TRS65和TRS85雙敲除所引起的囊泡運輸缺陷較單敲除更為嚴重;通過利用熒光蛋白標記的胞內(nèi)不同位點的標志蛋白和細胞活體染色技術(shù)，初步確認了TRS85敲除或TR

6、S65和TRS85雙敲除所引起的GFP-Snc1蛋白運輸受阻于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，而從質(zhì)膜向內(nèi)體運輸?shù)膬?nèi)吞途徑未受影響。在氮素營養(yǎng)缺乏條件下，TRS65敲除菌株細胞中Snc1向液泡的運輸也出現(xiàn)了受阻現(xiàn)象。有關(guān)TRAPP復合體公用必需亞基Bet3參與囊泡運輸?shù)墓δ芤延幸恍﹫蟮?，本論文中進一步將CPY-GFP整合入bet3ts菌株，發(fā)現(xiàn)Bet3突變導致CPY在營養(yǎng)豐富條件和氮素營養(yǎng)缺乏條件下向液泡的運輸均受阻，情況類似于Ypt1突變所引起的運輸

7、缺陷，說明Bet3亞基參與了CPY所代表的囊泡運輸。
　　 2.TRAPP復合體亞基突變所引起的生長、囊泡運輸及液泡形態(tài)的異?？梢酝ㄟ^其對應(yīng)小G蛋白的過量表達來進行抑制在trs85Δts及trs65Δtrs85Δts等溫敏感型菌株中過量表達調(diào)控物質(zhì)進出高爾基體的小G蛋白Ypt1和Ypt31，發(fā)現(xiàn)突變體的高溫敏感性、GFP-Snc1運輸缺陷以及液泡的碎裂缺陷可以通過過量表達Ypt1而不是Ypt31進行抑制。這些結(jié)果與trs130t

8、s菌株的高溫敏感性、GFP-Snc1運輸缺陷以及液泡的碎裂缺陷可以通過過量表達Ypt31而不是Ypt1進行抑制構(gòu)成對應(yīng)關(guān)系，表明TRAPP復合體亞基可通過其對應(yīng)的小G蛋白調(diào)控相關(guān)的生理過程。
　　 3.Trs65和Trs85參與了饑餓處理條件下非自噬蛋白向液泡的運輸跟蹤了非自噬蛋白GFP-Snc1和GFP-Snc1-PEM在饑餓條件下向液泡中運輸?shù)囊?guī)律，發(fā)現(xiàn)TRS85敲除或TRS65和TRS85雙敲除菌株對饑餓處理的響應(yīng)速度較野

9、生型和TRS65單敲除菌株慢，響應(yīng)程度也明顯低。當用FM4-64染料對饑餓處理20小時的GFP-Snc1-PEM整合菌株進行染色，發(fā)現(xiàn)TRS85敲除或TRS65和TRS85雙敲除細胞的液泡內(nèi)大部分為空的，而野生型和TRS65敲除細胞的液泡內(nèi)充滿了內(nèi)容物。Trs65雖然不顯著影響細胞自噬過程，但饑餓處理導致大量GFP-Snc1在trs65Δ細胞中的累積。這些結(jié)果說明Trs65和Trs85均參與響應(yīng)饑餓處理后物質(zhì)向液泡的定向運輸過程。

10、>　　 4.Trs85或Trs65和Trs85共同參與了饑餓處理后單個圓形液泡的形成細胞饑餓處理后，隨時間的進程，發(fā)現(xiàn)trs65Δ菌株、trs85Δts菌株、trs65Δtrs85Δts菌株及其野生型菌株細胞的液泡都有變成單個圓形液泡的趨勢，但是在變化速度和程度上存在較大的差異。TRS85敲除和TRS65與TRS85雙敲除菌株中最終單個圓形液泡率低于野生型菌株，經(jīng)方差分析表明存在顯著性差異，說明Trs85或Trs65和Trs85共同參

11、與了饑餓處理后液泡的融合過程。
　　 5.Bet3參與細胞自噬并部分通過小G蛋白Ypt1起作用通過在bet3ts菌株中整合GFP-Atg8、Atg9-3×GFP以及RFP-Ape1等自噬相關(guān)蛋白，研究了這些蛋白在營養(yǎng)豐富和營養(yǎng)缺乏條件下的運輸情況，并結(jié)合Western blot技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Bet3亞基參與了細胞的Cvt途徑(Cytoplasm to Vacuole Targeting pathway)和巨自噬，其突變會導致RFP-

12、Ape1在胞內(nèi)形成一個亮的圓點，而GFP-Atg8無法向液泡運送等嚴重的自噬缺陷表型。進一步統(tǒng)計分析表明野生型和突變體間GFP-Atg8與RFP-Ape1的共定位率、Atg9-3×GFP與RFP-Ape1的共定位率以及Atg9-3×GFP點的亮度和直徑，都有顯著性差異。此外通過TAKA試驗，表明Bet3突變影響了Atg9向PAS（Pre-autophagosomal structure/Phagophore assembly site）

13、的順向運輸。這些結(jié)果說明，Bet3突變影響了Atg8的募集和Atg9的運輸，從而導致細胞自噬無法進行?；贐et3可能通過TRAPP復合體作用于Ypt小G蛋白Ypt1和Ypt31/32調(diào)控細胞自噬的可能性，本研究探討了細胞自噬過程中Bet3與Ypt小G蛋白Ypt1和Ypt31之間的關(guān)系，結(jié)果表明，在營養(yǎng)豐富條件下，Ypt1和Ypt31單獨過量表達或同時過量表達均無法抑制Bet3突變所導致的自噬功能缺陷;而在營養(yǎng)缺乏的條件下，Ypt1可部