釀酒酵母中TRAPP復(fù)合體的三個(gè)亞基在囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞自噬中的功能研究.pdf

1、囊泡運(yùn)輸與細(xì)胞自噬是真核生物維持正常生命活動(dòng)所必需的基本生理過程。囊泡運(yùn)輸是實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移的重要途徑，而細(xì)胞自噬則是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和應(yīng)對(duì)環(huán)境因子的脅迫所必需的一類亞細(xì)胞降解途徑。
　　 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）體內(nèi)的囊泡運(yùn)輸受到Y(jié)pt/Rab類小G蛋白(GTPase)的調(diào)控，而小G蛋白的活性又受到鳥苷酸交換因子(GEFs)和GTPase激活蛋白(GAPs)的調(diào)節(jié)。釀酒酵母中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顆粒(Tr

2、ansport Protein Particle，TRAPP)復(fù)合體是一類拴系因子，同時(shí)也是小G蛋白Ypt1和Ypt31/32的GEFs，可激活相應(yīng)的小G蛋白。目前酵母中已報(bào)道的TRAPP復(fù)合體有三類:TRAPPⅠ、TRAPPⅡ和TRAPPⅢ，分別在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的囊泡運(yùn)輸、高爾基體內(nèi)部及離開高爾基體的運(yùn)輸和細(xì)胞自噬過程中起作用。這些TRAPP復(fù)合體由六個(gè)共同的亞基(Bet3、Bet5、Trs20、Trs23、Trs31、Trs33)

3、構(gòu)成TRAPPⅠ核心復(fù)合體，在此基礎(chǔ)上，TRAPPⅡ還含有Trs120、Trs130、Trs65和Tca17四個(gè)特異性亞基，TRAPPⅢ含有Trs85特異性亞基。這些亞基中，Bet3作為共有必需亞基，在囊泡運(yùn)輸中有著非常重要的作用;Trs65是一種只存在于真菌，而尚未在哺乳動(dòng)物等高等真核生物中發(fā)現(xiàn)的蛋白，其主要起到組裝和穩(wěn)定TRAPPⅡ復(fù)合體的作用;而Trs85則主要作用于細(xì)胞自噬的啟動(dòng)過程。已有越來越多的證據(jù)顯示小G蛋白及其GEFs除

4、了在調(diào)控囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮作用之外，也參與對(duì)細(xì)胞自噬過程的調(diào)節(jié)。但是，至今沒有研究系統(tǒng)地比較TRAPP復(fù)合體的同一亞基在囊泡運(yùn)輸與細(xì)胞自噬過程中的不同功能及分析囊泡運(yùn)輸與細(xì)胞自噬過程之間的關(guān)聯(lián)性。本論文將就三種具有代表性的TRAPP復(fù)合體亞基Bet3、Trs65和Trs85在囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞自噬過程中的作用開展研究并進(jìn)行比較，得到如下主要結(jié)果:
　　 1.Trs65、Trs85及Bet3參與了胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸利用四分體分離技術(shù)和直接敲除

5、法得到了trs65Δ菌株、trs85Δts菌株和trs65Δtrs85Δts菌株，并對(duì)上述菌株的胞內(nèi)Snc1蛋白所代表的囊泡運(yùn)輸情況進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)豐富的條件下，TRS65敲除未引起Snc1運(yùn)輸?shù)漠惓?，TRS85敲除則引起了Snc1極性運(yùn)輸功能的喪失，在胞內(nèi)呈彌散狀;TRS65和TRS85雙敲除所引起的囊泡運(yùn)輸缺陷較單敲除更為嚴(yán)重;通過利用熒光蛋白標(biāo)記的胞內(nèi)不同位點(diǎn)的標(biāo)志蛋白和細(xì)胞活體染色技術(shù)，初步確認(rèn)了TRS85敲除或TR

6、S65和TRS85雙敲除所引起的GFP-Snc1蛋白運(yùn)輸受阻于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，而從質(zhì)膜向內(nèi)體運(yùn)輸?shù)膬?nèi)吞途徑未受影響。在氮素營養(yǎng)缺乏條件下，TRS65敲除菌株細(xì)胞中Snc1向液泡的運(yùn)輸也出現(xiàn)了受阻現(xiàn)象。有關(guān)TRAPP復(fù)合體公用必需亞基Bet3參與囊泡運(yùn)輸?shù)墓δ芤延幸恍﹫?bào)道，本論文中進(jìn)一步將CPY-GFP整合入bet3ts菌株，發(fā)現(xiàn)Bet3突變導(dǎo)致CPY在營養(yǎng)豐富條件和氮素營養(yǎng)缺乏條件下向液泡的運(yùn)輸均受阻，情況類似于Ypt1突變所引起的運(yùn)輸

7、缺陷，說明Bet3亞基參與了CPY所代表的囊泡運(yùn)輸。
　　 2.TRAPP復(fù)合體亞基突變所引起的生長、囊泡運(yùn)輸及液泡形態(tài)的異?？梢酝ㄟ^其對(duì)應(yīng)小G蛋白的過量表達(dá)來進(jìn)行抑制在trs85Δts及trs65Δtrs85Δts等溫敏感型菌株中過量表達(dá)調(diào)控物質(zhì)進(jìn)出高爾基體的小G蛋白Ypt1和Ypt31，發(fā)現(xiàn)突變體的高溫敏感性、GFP-Snc1運(yùn)輸缺陷以及液泡的碎裂缺陷可以通過過量表達(dá)Ypt1而不是Ypt31進(jìn)行抑制。這些結(jié)果與trs130t

8、s菌株的高溫敏感性、GFP-Snc1運(yùn)輸缺陷以及液泡的碎裂缺陷可以通過過量表達(dá)Ypt31而不是Ypt1進(jìn)行抑制構(gòu)成對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明TRAPP復(fù)合體亞基可通過其對(duì)應(yīng)的小G蛋白調(diào)控相關(guān)的生理過程。
　　 3.Trs65和Trs85參與了饑餓處理?xiàng)l件下非自噬蛋白向液泡的運(yùn)輸跟蹤了非自噬蛋白GFP-Snc1和GFP-Snc1-PEM在饑餓條件下向液泡中運(yùn)輸?shù)囊?guī)律，發(fā)現(xiàn)TRS85敲除或TRS65和TRS85雙敲除菌株對(duì)饑餓處理的響應(yīng)速度較野

9、生型和TRS65單敲除菌株慢，響應(yīng)程度也明顯低。當(dāng)用FM4-64染料對(duì)饑餓處理20小時(shí)的GFP-Snc1-PEM整合菌株進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)TRS85敲除或TRS65和TRS85雙敲除細(xì)胞的液泡內(nèi)大部分為空的，而野生型和TRS65敲除細(xì)胞的液泡內(nèi)充滿了內(nèi)容物。Trs65雖然不顯著影響細(xì)胞自噬過程，但饑餓處理導(dǎo)致大量GFP-Snc1在trs65Δ細(xì)胞中的累積。這些結(jié)果說明Trs65和Trs85均參與響應(yīng)饑餓處理后物質(zhì)向液泡的定向運(yùn)輸過程。

10、>　　 4.Trs85或Trs65和Trs85共同參與了饑餓處理后單個(gè)圓形液泡的形成細(xì)胞饑餓處理后，隨時(shí)間的進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)trs65Δ菌株、trs85Δts菌株、trs65Δtrs85Δts菌株及其野生型菌株細(xì)胞的液泡都有變成單個(gè)圓形液泡的趨勢(shì)，但是在變化速度和程度上存在較大的差異。TRS85敲除和TRS65與TRS85雙敲除菌株中最終單個(gè)圓形液泡率低于野生型菌株，經(jīng)方差分析表明存在顯著性差異，說明Trs85或Trs65和Trs85共同參

11、與了饑餓處理后液泡的融合過程。
　　 5.Bet3參與細(xì)胞自噬并部分通過小G蛋白Ypt1起作用通過在bet3ts菌株中整合GFP-Atg8、Atg9-3×GFP以及RFP-Ape1等自噬相關(guān)蛋白，研究了這些蛋白在營養(yǎng)豐富和營養(yǎng)缺乏條件下的運(yùn)輸情況，并結(jié)合Western blot技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Bet3亞基參與了細(xì)胞的Cvt途徑(Cytoplasm to Vacuole Targeting pathway)和巨自噬，其突變會(huì)導(dǎo)致RFP-

12、Ape1在胞內(nèi)形成一個(gè)亮的圓點(diǎn)，而GFP-Atg8無法向液泡運(yùn)送等嚴(yán)重的自噬缺陷表型。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析表明野生型和突變體間GFP-Atg8與RFP-Ape1的共定位率、Atg9-3×GFP與RFP-Ape1的共定位率以及Atg9-3×GFP點(diǎn)的亮度和直徑，都有顯著性差異。此外通過TAKA試驗(yàn)，表明Bet3突變影響了Atg9向PAS（Pre-autophagosomal structure/Phagophore assembly site）

13、的順向運(yùn)輸。這些結(jié)果說明，Bet3突變影響了Atg8的募集和Atg9的運(yùn)輸，從而導(dǎo)致細(xì)胞自噬無法進(jìn)行?；贐et3可能通過TRAPP復(fù)合體作用于Ypt小G蛋白Ypt1和Ypt31/32調(diào)控細(xì)胞自噬的可能性，本研究探討了細(xì)胞自噬過程中Bet3與Ypt小G蛋白Ypt1和Ypt31之間的關(guān)系，結(jié)果表明，在營養(yǎng)豐富條件下，Ypt1和Ypt31單獨(dú)過量表達(dá)或同時(shí)過量表達(dá)均無法抑制Bet3突變所導(dǎo)致的自噬功能缺陷;而在營養(yǎng)缺乏的條件下，Ypt1可部