多氧霉素生物合成機(jī)理及其代謝工程研究.pdf

1、多氧霉素(Polyoxin，POL)是重要的肽基核苷類抗生素，由于其對農(nóng)作物、果蔬及一些經(jīng)濟(jì)植物真菌病害有良好防治作用，加之對環(huán)境友好，故自創(chuàng)制成功便在農(nóng)業(yè)上大規(guī)模推廣使用；迄今為止，多氧霉素仍是世界上投產(chǎn)與使用最廣泛且未產(chǎn)生耐藥性的農(nóng)用抗生素之一。多氧霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)由核苷骨架及兩個后修飾氨基酸組成，其與幾丁質(zhì)的合成單元UDP-N-乙酰葡萄糖胺的結(jié)構(gòu)相似，因此為幾丁質(zhì)合成酶的強(qiáng)烈競爭性抑制劑。鑒于多氧霉素獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)與作用機(jī)理，科學(xué)家

2、們長期以來對其表現(xiàn)出濃厚的研究興趣，但其生物合成機(jī)理一直懸而未決。本研究旨在從分子水平上闡明多氧霉素獨特的生物合成機(jī)理，從而為利用代謝工程策略對多氧霉素產(chǎn)生菌株進(jìn)行分子改良，同時也為利用組合生物學(xué)手段產(chǎn)生具有更高生物活性的多氧霉素衍生物奠定理論基礎(chǔ)。
　　 以nikkomycin生物合成基因nik0出發(fā)，通過PCR擴(kuò)增到探針，進(jìn)而從S. cacaoi基因組文庫中克隆出多氧霉素的整個生物合成基因簇，同時對陽性cosmid SA7進(jìn)

3、行改造，成功實現(xiàn)多氧霉素在異源宿主S.lividansTK24中的工程化產(chǎn)生。生物信息學(xué)分析顯示測定的46-kb區(qū)域含有39個ORF，其中多氧霉素生物合成基因簇由16個結(jié)構(gòu)基因，2個調(diào)控基因及2個膜蛋白相關(guān)基因組成。采用在cosmid上直接同框缺失目標(biāo)基因和異源表達(dá)策略，確定出三個基因(poIF，poIC和poIE)負(fù)責(zé)POIA的生物合成，同時鑒定出poIL，poIN和poIM與CPOAA的生物合成相關(guān)。以此為基礎(chǔ)結(jié)合生物信息學(xué)分析成功

4、推斷出多氧霉素的整個生物合成途徑，并對早期推斷的生物合成途徑進(jìn)行了修正。
　　 PoIA與NikO具有較高同源性，PolO與氨甲酰轉(zhuǎn)移酶具有較高同源性；體內(nèi)實驗證明，poIA和polO與多氧霉素的生物合成直接相關(guān)，poIA突變株可以分別被poIA和nikO互補(bǔ)，但互補(bǔ)菌株產(chǎn)生的POL組分表現(xiàn)差異，暗示PoIA與NikO具有不同的底物偏好性。體外實驗證明，PolO為O-氨甲酰轉(zhuǎn)移酶；而PoIA與NikO為UMP烯醇式丙酮酰轉(zhuǎn)移酶，

5、二者催化功能一致，但表現(xiàn)出不同的催化效率，這與體內(nèi)互補(bǔ)實驗一致。
　　 PolB與胸苷酸合酶ThyX有較高同源性，研究揭示：poIB突變株主要積累POL-K組分，而野生型主要產(chǎn)生POL-A與POL-H組分，三者區(qū)別在于前者的核苷骨架含有C-5甲基化修飾，說明polB與該修飾直接相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)POL-K具有更高生物活性。S.cacaoi的thyX突變株在基本培養(yǎng)基上表現(xiàn)出零星生長表型，暗示該表型由poIB賦予；研究發(fā)現(xiàn)polB和t

6、hyX雙突變菌株在MM培養(yǎng)基上喪失生長表型，但可被poIB和thyX互補(bǔ)。進(jìn)一步研究顯示，polB可互補(bǔ)S.coelicolor的thyX突變株和E. coli的thyA突變株(CHI)恢復(fù)生長表型；不僅如此，CHI/poIB互補(bǔ)菌株對TMP產(chǎn)生抗性表型，說明PolB與ThyA具有不同催化機(jī)制。體外研究揭示PoIB含有的輔因子為FAD，并且PoIB為迄今發(fā)現(xiàn)的首例UMP甲基化酶，其能利用UMP與dUMP為底物生成相應(yīng)產(chǎn)物，這與體外實驗高

7、度一致。
　　 PoIP與精氨酸生物合成蛋白ArgB有較高同源性，研究發(fā)現(xiàn)poIP突變株仍有多氧霉素活性組分的部分產(chǎn)生能力，推測此表型可能由argB賦予。進(jìn)一步研究顯示，argB為精氨酸和多氧霉素的生物合成所必需，換言之，argB突變株同時喪失精氨酸和多氧霉素的產(chǎn)生能力，但該突變株可被argB和poIP互補(bǔ)，說明在S.cacaoi中精氨酸與多氧霉素的生物合成間存在間接調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，具體分子調(diào)控機(jī)理的闡明正在進(jìn)行之中。
　　

8、多氧霉素的三個構(gòu)造單元獨立合成，然后推測在PolG(ATP依賴的酰胺合成酶)的作用下進(jìn)行組裝。研究顯示，poIG同框缺失菌株直接積累POL-I和thymine POL-I組分，而poIG互補(bǔ)突變株恢復(fù)野生型表型，說明poIG只負(fù)責(zé)一個酰胺鍵的生物合成，另一個酰胺鍵的生物合成機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
　　 同時本研究以多氧霉素工業(yè)菌株為研究材料，構(gòu)建成其基因組文庫，并成功克隆出多氧霉素生物合成基因簇，序列比較分析顯示S. cacaoi