刀額新對(duì)蝦過(guò)敏原的加工穩(wěn)定性及特征肽的表征.pdf

1、食物過(guò)敏原標(biāo)簽是保護(hù)消費(fèi)者免受過(guò)敏疾病危害的主要措施之一，而高通量、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是進(jìn)行合理標(biāo)注的關(guān)鍵。但由于對(duì)過(guò)敏原在食品加工過(guò)程中的變化認(rèn)識(shí)不足，現(xiàn)有的過(guò)敏原檢測(cè)方法存在假陰性率高，結(jié)果差異性大，難以應(yīng)對(duì)不同加工食品中過(guò)敏原的檢測(cè)。為了充分認(rèn)識(shí)食品加工技術(shù)對(duì)過(guò)敏原的影響，并研究加工食品中過(guò)敏原的檢測(cè)方法，本研究以甲殼類海產(chǎn)品中的刀額新對(duì)蝦為研究對(duì)象，采用蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)的技術(shù)原理研究其在食品加工過(guò)程中的變化規(guī)律，鑒定在食品加工過(guò)程

2、中穩(wěn)定存在的過(guò)敏原特征肽，為進(jìn)一步研究過(guò)敏原的確證檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.選取凍干、烘干、凝膠和油炸4種常見食品加工方法處理的刀額新對(duì)蝦作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)蝦肉蛋白質(zhì)組分、免疫原性及抗酶解能力的分析，結(jié)果表明主要過(guò)敏原蛋白依然存在，免疫原性均有一定程度的下降，其中經(jīng)過(guò)凝膠處理的刀額新對(duì)蝦過(guò)敏原與IgG結(jié)合能力下降可達(dá)87％，凍干處理對(duì)其活性影響最小，僅降低了6.8％；而加工對(duì)過(guò)敏原的抗酶解能力沒有顯著

3、影響，主要過(guò)敏原在60min完全酶解，新產(chǎn)生的18.4 kD蛋白在酶解30 min時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)量。
　　 2.利用不同劑量的電子束輻照分別處理刀額新對(duì)蝦蝦肉組織、過(guò)敏原抽提液和純化的過(guò)敏原，通過(guò)檢測(cè)過(guò)敏原含量、免疫原性以及抗酶解能力的變化情況，研究電子束輻照對(duì)刀額新對(duì)蝦過(guò)敏原的影響。結(jié)果表明，在低劑量輻照處理后，蝦過(guò)敏原抽提液及純化的過(guò)敏原與IgG結(jié)合能力降低幅度在10％以內(nèi)，而肌肉組織中過(guò)敏原與IgG結(jié)合能力增強(qiáng)幅度可達(dá)20％

4、；10 kGy輻照處理后，過(guò)敏原抽提液與IgG結(jié)合能力降低了32.8％，純化的過(guò)敏原降低了29.8％，肌肉組織中過(guò)敏原降低了27.3％；而輻照后的蝦過(guò)敏原也在60 min完全酶解，新產(chǎn)生的18.4 kD蛋白在酶解30 min時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)量。
　　 3.通過(guò)對(duì)刀額新對(duì)蝦蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳分離，并利用Melanie7.0軟件對(duì)圖譜展現(xiàn)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析，共檢測(cè)到106個(gè)蛋白點(diǎn)，大部分蛋白點(diǎn)分布在等電點(diǎn)(pI)4.5-7和分子量(MW)

5、20-90 kD的區(qū)域。經(jīng)加工處理的蛋白分布有顯著性的差異，其中經(jīng)過(guò)油炸處理后，pI5-6 MW20-60 kD區(qū)域的蛋白質(zhì)明顯缺失，凝膠蝦丸處理的樣品在酸性端分子量20 kD附近產(chǎn)生了新的蛋白點(diǎn)，經(jīng)過(guò)輻照處理后的樣品在中性端30-50 kD附近的蛋白點(diǎn)明顯缺失，凍干處理對(duì)樣品的影響最弱，與對(duì)照匹配蛋白點(diǎn)達(dá)68個(gè)，說(shuō)明凍干樣品對(duì)蛋白質(zhì)的損失程度最弱。免疫印跡的結(jié)果顯示，刀額新對(duì)蝦共有11個(gè)蛋白點(diǎn)能夠與血清中IgE結(jié)合，主要分布在pI4.

6、5-7 MW20-60 kD區(qū)域。
　　 4.將雙向電泳分離、免疫鑒定的蛋白點(diǎn)進(jìn)行酶解后，利用MALKDI-MS和MALDI-MS/MS分析，結(jié)果采用Mascot搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行搜索鑒定。其中，1號(hào)蛋白點(diǎn)優(yōu)先匹配為刀額新對(duì)蝦的主要過(guò)敏原Met e1，將其肽段信息通過(guò)BLAST工具進(jìn)行相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Met e1與其它甲殼類以及節(jié)肢動(dòng)物如螨蟲、蜈蚣等的原肌球蛋白相似性>72％，而肽段124Ser-Lys139具有

7、特異性，唯一匹配為蝦原肌球蛋白，可作為特征肽；4號(hào)蛋白點(diǎn)與磷酸丙酮酸水合酶和烯醇化酶兩種蛋白相匹配，兩種蛋白的相似度可達(dá)99％，其中肽段198Gly-Lys221與40多種物種的烯醇化酶相匹配，肽段273Ile-Arg279磷酸丙酮酸水合酶唯一匹配，可分別作為烯醇化酶的通用特征肽和磷酸丙酮酸水合酶的特征肽；而5號(hào)蛋白點(diǎn)與一種細(xì)菌(Runella slithyformis)的外膜外排蛋白的序列覆蓋度達(dá)24％，其所有肽段與外膜外排蛋白唯一匹