肺炎克雷伯氏菌莢膜糖蛋白的制備和免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要論文研究了肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae，Kp)莢膜糖蛋白的檢測方法、發(fā)酵工藝、提取工藝和免疫調(diào)節(jié)作用，確定了Kp發(fā)酵制備英膜糖蛋白的最佳培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵工藝參數(shù)、提取工藝條件，建立并改進(jìn)了Kp發(fā)酵液和產(chǎn)品英膜糖蛋白含量的間接ELISA檢測方法。冬要內(nèi)容如下:1.以Kp莢膜糖蛋白為免疫原，獲得了兔抗Kp莢膜糖蛋白抗血清，通過硫酸錢分級沉淀法與吸附法對抗血清進(jìn)行純化，制備得到特異性強(qiáng)、

2、效價高的Kp英膜糖蛋白抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了Kp莢膜糖蛋白間接ELISA檢測法。該法的檢測靈敏度為0.03111gml，線性檢測范圍為2.5ugml30.0ugml，批內(nèi)誤差為1.04%3.22Yo批間誤差為2.61%^8.35。實(shí)驗(yàn)還研究了Kp發(fā)酵液全菌ELISA檢測法，為發(fā)酵工藝的優(yōu)化和發(fā)酵過程的監(jiān)控奠定了基礎(chǔ)。2.通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定了適于Kp生長和產(chǎn)英膜糖蛋白活性物質(zhì)的最佳培養(yǎng)基配方:蔗糖4%胰蛋白陳2%酵母粉0.1

3、%KzS00.1%MgSO0.025%MM0.4%NaHPO0.3%pH6.0并確定了最適搖瓶發(fā)酵工藝為:接種量2%(種齡5h)500ml擋板瓶裝液量16%，搖床轉(zhuǎn)速150r加in37℃培養(yǎng)3.5h。搖瓶培養(yǎng)收獲發(fā)酵液中菌體濃度為1.sX100cfu向1，全菌ELISA活性為1.382。在搖瓶實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了7L罐放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液中菌體濃度可達(dá)到2.4X10“efuml，全菌ELISA活性為1.28603.研究了Kp英膜糖蛋白的提取工

4、藝，確定了菌體的裂解方法為胰蛋白酶結(jié)合NP40和溶菌酶共同裂解確定了裂解液的濃縮和初步分離采用中空纖維濾膜超濾確定了糖蛋白的沉淀?xiàng)l件為5倍體積甲醇和甲縮醛(1:4)，劇烈攪拌1h確定了莢膜糖蛋白的粗提工藝為:發(fā)酵液~裂解一超濾~沉淀糖蛋白~去除雜蛋白~沉淀回收確定了莢膜糖蛋白的純化工藝為離子交換層析結(jié)合凝膠排阻層析。最終確定了發(fā)酵液~裂解~超濾一沉淀糖蛋白~去除雜蛋白~沉淀回收~離子交換層析、凝膠排阻層析的Kp莢膜糖蛋白制備工藝。采用以

5、上工藝的搖瓶發(fā)酵液提取后的莢膜糖蛋白粗品產(chǎn)量為2.02gL發(fā)酵液，其有效成分含量為10.2(相當(dāng)于0.206gL發(fā)酵液)，粗品經(jīng)純化，所得莢膜糖蛋白產(chǎn)品的產(chǎn)量為0.151gL發(fā)酵液，其中有效成分含量為81.3%(相當(dāng)于0.123gL發(fā)酵液)，純化后的得率為59.7%，純度是粗品天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文ABSTRACTTheindirectenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)thefermentati

6、onconditionstheextractionmethodsandtheimmunocompetenceofKlebsiellapneumoniae(Kp)capsuleglycoproteinwereinvolved.Themainresearchcontentsandresultswereasfollows:Aindirectenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)wasdevelopedtod

7、etectandquantitatetheKlebsiellapneumoniaeanditscapsuleglycoprotein.ThespecificandhightiterrabbitantiserumofKpcapsuleglycoproteinwaspreparedsuccessfullyusingapurifiedKpglycoproteinasantigenandwaspurifiedwithammoniumsulfat

8、efractionationandadsorption.Thesensitivityoftheassayis0.03111grul.Thestandardcurveislinearfrom2.5ugmlto301agml.Theerrorofinterplateisfrom1.04%to3.22%andtheerrorofintraplateisfrom2.61%to8.35%Theresultsofsinglefactorandort

9、hogonalexperimentshowedthattheoptimizedmediumcompositioncontained:sucrose4%tryptone2%yeastinfusion伽wder)0.1%從S040.1%，MgS040.025%，KH2PO40.4%，Na2HP040.3%.Theoptimizedfermentationconditionsinshakeflaskwereasfollows:inoculum

10、ageShinoculumsize2%temperature370Cvolumeofmedium16%shakerspeed150rminpH6.0fermentationtime3.5h.Theyieldofshakeflaskfermentationwas1.9X100cfumlanditwasimprovedto2.4XID0cfulmlinbatchcultureTheextractionmethodsofKpcapsulegl

11、ycoproteinwasstudied.Thebacteriawaslysed妙ttypsinNP40andlysozyrne.Thelysatewasconcentratedbyultrafiltrationon50kDamolecularfiltermembraneandwasextractedlhbymethanolanddimethoxymethane(1:4)5timesofvolumeunderagitation.Afte

12、rdeproteinationprecipitationanddryingtheyieldofroughextractedpreparationwas2.02gLcontaining10.2%availablecomponent.Thentheextractedpreparationwaspurifiedbyionexchangechromatographyandgelexclutionchromatography.Thefinalyi