可見光引發(fā)的表面可控-活性接枝交聯(lián)聚合及應(yīng)用于酶固定化研究.pdf

1、將酶固定化在基材之上既可以使固定化的酶重復(fù)利用，降低酶的催化成本，又具有使酶在反應(yīng)結(jié)束后容易與底物分離，避免酶對底物污染的優(yōu)點(diǎn)。聚合物材料因其低成本、易加工以及柔性等特點(diǎn)成為酶固定化的一種重要基材。但聚合物基材普遍存在表面能低和表面惰性的缺點(diǎn)，因此需要對基材表面進(jìn)行改性以固定化酶。本論文基于可見光可控/活性接枝交聯(lián)聚合方法，設(shè)計(jì)了一種反應(yīng)溫和且條件簡單的在聚合物基材表面固定化酶新方法，并對其固定化酶的應(yīng)用進(jìn)行了探究。該方法首先在聚合物基

2、材表面種植光引發(fā)劑異丙基硫雜蒽酮(ITX)，之后在接枝有ITX的聚合物基材表面引發(fā)可交聯(lián)單體聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的可控/活性接枝聚合。若在接枝過程前將單體溶液與酶相混合，接枝反應(yīng)后即可實(shí)現(xiàn)酶在聚乙二醇(PEG)網(wǎng)布之中的原位網(wǎng)格固定。論文主要取得以下結(jié)果:
　　1、探究了可見光可控/活性接枝交聯(lián)聚合的機(jī)理，并利用該反應(yīng)在低密度聚乙烯(LDPE)膜表面分別通過三明治結(jié)構(gòu)以及凹槽結(jié)構(gòu)接枝PEG網(wǎng)布用以原位網(wǎng)格固定化脂肪酶，

3、并使用該載酶膜催化合成葡萄糖棕櫚酸酯。通過控制接枝反應(yīng)時(shí)間、單體溶液中PEGDA的含量以及接枝反應(yīng)的加液量，可以對接枝厚度之范圍進(jìn)行大規(guī)模精確可控（10-1-103μm）。又通過XPS表征分析發(fā)現(xiàn)，接枝網(wǎng)布層上仍然含有ITX殘基，從而證明了接枝聚合的“活性”特征?？梢姽廨椪?小時(shí)的酶膜其活性是使用紫外光輻照150秒的酶膜的5倍。當(dāng)溫度為50℃時(shí)，網(wǎng)格固定的脂肪酶其酯化率由游離酶的42％上升為67％。當(dāng)使用0.5％(v/v)的戊二醛(GA

4、)對脂肪酶交聯(lián)后，固定化脂肪酶的酶活為0.71U，酶載率為89％，催化7批活性沒有發(fā)生明顯下降。
　　2、在聚合物基材表面接枝柔性聚合物刷來固定化纖維素酶催化濾紙（纖維素）水解反應(yīng)。以無紡布為基材，當(dāng)使用的接枝聚合單體溶液比例丙烯酸(AA)為30％(v/v)，PEGDA為20％(v/v)吸附固定化酶時(shí)，在0.01mol·L-1的檸檬酸緩沖液中進(jìn)行催化，固定化纖維素酶的催化效率可達(dá)到最高的45％，但使用六個(gè)批次后催化效率降為了5％;

5、而在無紡布接枝的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯刷(PGMA)上連接聚乙烯亞胺(PEI)后，使用GA將纖維素酶上的氨基與PEI進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)，在同樣催化條件下，催化反應(yīng)持續(xù)10個(gè)批次，催化濾紙水解率基本不變。
　　3、為了提升纖維素的水解效率并降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本，設(shè)計(jì)了一種在聚丙烯無紡布之上使用可見光可控/活性接枝聚合原位網(wǎng)格固定β-葡萄糖苷酶(BG)于PEG網(wǎng)布中的手段。通過SEM、AFM、XPS以及CLSM等儀器對BG酶膜進(jìn)行表征，

6、證明了BG酶成功的固定在了無紡布之上的PEG網(wǎng)格之中。固定化BG酶膜催化濾紙（纖維素）水解之最適合條件為:0.25％(v/v)的GA對55mg BG酶交聯(lián)處理半小時(shí)，加入100μL的游離纖維素酶，在50℃以及pH為4.8的檸檬酸緩沖液中進(jìn)行水解反應(yīng)。與不加入BG酶膜的體系相比，其水解纖維素的轉(zhuǎn)化率在48小時(shí)內(nèi)提高了40％。對BG酶進(jìn)行GA(0.25％，v/v)交聯(lián)，98％的酶被固定在網(wǎng)格之中，固定化BG酶在反應(yīng)15個(gè)批次后仍保留有較高的

7、活性。
　　4、在可見光可控/活性接枝聚合的基礎(chǔ)之上，以胰蛋白酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶為例，提出了一種分隔網(wǎng)格固定化多酶的方法，制備了雙酶分隔固定化酶膜（A型和B型）。雙酶分隔固定化酶膜（A型）利用活性接枝的特點(diǎn)，在一層固定化酶的聚合物網(wǎng)布之上接枝另一層固定化酶聚合物網(wǎng)布;而雙酶分隔固定化酶膜（B型）則將兩種酶的單體可聚合溶液涂敷在膜的兩側(cè)從而一步法分隔固定化兩種酶。使用XPS以及AFM等對兩種膜分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)的表征，結(jié)果表明兩種酶均可以

8、成功的固定化在不同的網(wǎng)布層之中。制備的雙酶分隔固定化酶膜大于90％的酶不會發(fā)生泄漏。與混合固定化酶相比，分隔固定化酶的酶活性保留更多，在重復(fù)使用4個(gè)批次以后，其活性并沒有發(fā)生明顯的下降。以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了“固定化多酶串并聯(lián)系統(tǒng)”。并以脂肪酶、胰蛋白酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶為例，利用此系統(tǒng)制備了新型抗腫瘤靶向藥物L(fēng)TV-阿扎胞苷和LTV-阿糖胞苷。使用FT-IR、NMR以及MS等對靶向藥物的合成過程進(jìn)行表征，靶向藥物結(jié)構(gòu)符合預(yù)期。對靶向藥物進(jìn)行了