中華真地鱉抗氧化活性肽的分離及鑒定.pdf

1、地鱉蟲是一種傳統(tǒng)的中藥材，具有散淤血、解凝活血、接骨續(xù)筋、消腫止痛等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，地鱉蟲還有調(diào)節(jié)血脂、溶血栓、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抑制乙酰膽堿酯酶活性等功效。中華真地鱉(EupolyphagasinensisWalker)是地鱉蟲中藥食兼用的一個種，干品蛋白質(zhì)含量高達60％以上，氨基酸種類齊全，并且含有豐富的脂肪酸和微量礦物質(zhì)元素。隨著人們對中華真地鱉藥用價值和營養(yǎng)價值的認識，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，成為農(nóng)民增收的新途徑。但是其

2、利用還停留在全蟲入藥或油炸地鱉、地鱉浸泡酒等傳統(tǒng)方式，這些不能滿足現(xiàn)代社會不同層次的消費要求，并制約著中華真地鱉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。高蛋白的中華真地鱉是生物活性肽的優(yōu)良原料，將其精加工成具有高附加值的生物活性肽，可以豐富抗氧化肽的種類，發(fā)展中華真地鱉產(chǎn)業(yè)。
　　 本文以中華真地鱉為研究對象，經(jīng)脫脂、酶解、超濾后得中華真地鱉酶解物，研究其體外、體內(nèi)抗氧化活性。并采用陰離子交換層析、凝膠層析、反相高效液相、質(zhì)譜等方法，對活性較高組分進行分離

3、純化和氨基酸序列鑒定。結果如下:
　　 1.采用從蜘蛛腸道分離的Arazyme蛋白酶酶解中華真地鱉蛋白，將酶解物超濾、冷凍干燥后得到中華真地鱉酶解物。研究其自由基清除能力、還原能力和對脂質(zhì)過氧化的抑制能力。結果表明，其對二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)、羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)均有較強的清除能力，IC50分別為1.32、0.40和8.73mg/mL;肽含量為1.8mg/mL時，還原能力達0.3152;向

4、亞油酸自氧化體系中加入含2mg多肽的酶解物后，其對亞油酸自氧化反應的抑制率達88％，效果好于2mg的α-生育酚。說明中華真地鱉酶解物具有較強的體外抗氧化活性。
　　 2.將中華真地鱉酶解物灌胃D-半乳糖致衰老小鼠，測定小鼠血漿和肝臟組織中丙二醛(MDA)含量、·OH清除能力以及總過氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活力，結果顯示，與模型組相比，小鼠血漿和肝臟組織勻漿中MDA含量極顯

5、著(P＜0.01)降低，對·OH的清除能力顯著(P＜0.05)增強，其T-SOD(P＜0.05)、GSH-PX(P＜0.01)和CAT(P＜0.05)活力顯著升高。說明中華真地鱉酶解物能顯著抑制D-半乳糖致衰老小鼠的衰老。
　　 3.將中華真地鱉酶解液在4℃放置12h，分為沉淀(F1)和上清液(F2)兩部分。利用RP-HPLC對F1進行分離，得到純度較高的組分F1-1，其濃度在100μm/mL時對DPPH·的清除率為53.30％

6、。經(jīng)鑒定其分子量為335.03，氨基酸序列為天冬氨酸-纈氨酸-半胱氨酸（Asp-Val-Cys）;利用DEAE-SephadexA-50離子交換層析、SephadexG-15凝膠以及RP-HPLC對中華真地鱉多肽F2進行分離。陰離子分離得到3個組分，組分F2-2對DPPH·、·OH和O2-·的清除能力最強，IC50分別為1.09、0.27和5.98mg/mL;凝膠分離F2-2得到3個組分，F(xiàn)2-2-3對DPPH·、·OH和O2-·的清除