R-乙基-3-羥基戊二酸酯間接生物合成路徑轉(zhuǎn)化新體系的建立.pdf

1、他汀類藥物作為非常有效的降血脂藥物，是全球的暢銷藥。尤其是第三代他汀類藥物瑞舒伐他汀在治療冠狀動(dòng)脈疾病方面表現(xiàn)出非常好的療效。3，5-二羥基庚酸側(cè)鏈?zhǔn)侨鹗娣ニ〉年P(guān)鍵性側(cè)鏈，它是由手性化合物R-乙基-3-羥基戊二酸酯合成而來。因此，R-乙基-3-羥基戊二酸酯是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。開發(fā)高效率、低成本、低污染的R-乙基-3-羥基戊二酸酯生產(chǎn)工藝，對于降低瑞舒伐他汀價(jià)格，提高產(chǎn)品質(zhì)量，增強(qiáng)我國制藥企業(yè)在該領(lǐng)域的國際競爭力，具有深遠(yuǎn)的意義。本研

2、究旨在開發(fā)以R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯為底物的R-乙基-3-羥基戊二酸酯高效生物合成方法。
　　 ⑴檢測方法的開發(fā)。目前尚未有檢測方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯、R-乙基-4-氨甲酰基-3-羥基丁酸酯和R-乙基-3-羥基戊二酸酯在線檢測的分析方法，而這三種物質(zhì)同時(shí)在線分析對于確定反應(yīng)路徑具有重要作用。通過對三種化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的分析，基于離子化合物在高效反相色譜洗脫中的特殊性質(zhì)，最后確立了實(shí)現(xiàn)三

3、種化合物同時(shí)分離的液相方法。對流動(dòng)相組成和pH值進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)洗脫條件為：Hypersil ODS C18柱；檢測波長210 nm；流動(dòng)相為甲醇/50 mM磷酸鈉鹽緩沖液(3:7，v/v，pH6.5)；柱溫40℃。通過驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法具有良好的線性，重復(fù)性，專一性，較低的檢測限和定量限，較短的樣品分析時(shí)間。
　　 ⑵目標(biāo)菌株的篩選。通過對采自江蘇梅山和海南五指山的兩份土樣進(jìn)行選擇性篩選和顯色篩選，獲得了一批具有腈水解酶活性的

4、野生菌，但活性相對較弱，未能達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)的要求。采用PCR高通量篩選方法，對混合菌落基因組DNA進(jìn)行篩選，獲得兩條腈水解酶基因的保守序列。對實(shí)驗(yàn)室已有的腈水解酶產(chǎn)生菌進(jìn)行篩選，Rhodococcus boritolerans在轉(zhuǎn)化當(dāng)前底物R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯產(chǎn)生R-乙基-3-羥基戊二酸酯上，表現(xiàn)出很好的活性。
　　 ⑶反應(yīng)路徑的確定及化合物鑒定。為了進(jìn)一步了解該反應(yīng)進(jìn)行的路徑，反應(yīng)過程進(jìn)行全程取樣監(jiān)控。高效液相檢

5、測結(jié)果顯示該反應(yīng)存在中間體，可能是一個(gè)由兩步反應(yīng)組成的間接反應(yīng)。通過以R-乙基-4-氨甲酰基-3-羥基丁酸酯為底物進(jìn)行上述反應(yīng)，最終得到R-乙基-3-羥基戊二酸酯，由此進(jìn)一步證實(shí)以上間接路徑。將上述中間體和產(chǎn)物分別進(jìn)行質(zhì)譜、超導(dǎo)核磁共振(NMR)、旋光分析，結(jié)果顯示以上分析數(shù)據(jù)與R-乙基-4-氨甲?；?3-羥基丁酸酯和R-乙基-3-羥基戊二酸酯已報(bào)道的相關(guān)數(shù)據(jù)一致。因此，該反應(yīng)的路徑最終確定為以R-乙基-4-氨甲酰基-3-羥基丁酸酯為中

6、間體的間接路徑，并由此推斷Rhodococcus boritolerans中可能同時(shí)存在腈水合酶和酰胺酶。
　　 ⑷反應(yīng)條件優(yōu)化。通過對酶催化反應(yīng)的溫度、pH、底物濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到該反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為：25℃，pH7.5，10 g/L R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯。在該反應(yīng)條件下，反應(yīng)的最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.5％(w/w)，這是目前報(bào)道的從R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯到R-乙基-3-羥基戊二酸酯的最高轉(zhuǎn)化率。加