基于金納米樹脂復合微球檢測肺癌標志物的電化學和SERS研究.pdf

1、樹脂微球因其具有形貌和大小可控，良好的穩(wěn)定性及生物相容性等特征，其在生物醫(yī)學領域的應用引起廣泛的關注。樹脂微球攜帶多種活性基團(如羥基、醛基、羧基、氨基等)，既可以進行化學修飾而實現(xiàn)不同的功能，也可以直接偶聯(lián)生物酶、抗體及藥物。本論文主要研究以多巴胺、氨基水楊酸、血清胺和色氨酸四種單體來制備樹脂微球，并以其為模板制備出了金納米樹脂復合微球。金納米樹脂復合微球是將金納米顆粒修飾到樹脂微球上形成的復合材料，因其導電性強和表面增強拉曼散射(S

2、urface enhanced Raman scattering，SERS)活性高而被應用到電化學和SERS分析領域。篩選出具有可區(qū)分的電化學和SERS特征峰的分子標記到金納米樹脂復合微球上，構建基于電化學和SERS檢測技術的免疫傳感器來檢測一種或多種肺癌標志物。
　　本論文具體開展了如下工作:
　　1.以多巴胺、氨基水楊酸、血清胺和色氨酸四種反應單體來制備不同粒徑的樹脂微球。研究反應單體的量對合成樹脂微球形貌的影響;討論了

3、化學結構與樹脂微球粒徑的大小關系。將金納米顆粒修飾到樹脂微球上形成金納米樹脂復合微球。研究并討論了不同濃度的氯金酸對樹脂微球上金納米顆粒形貌的影響。樹脂微球上的金納米顆粒之間存在著微小的距離，這可以產生很強的“熱點”效應有利于增強SERS信號。金納米樹脂復合微球上的金納米顆粒具有良好的導電性和SERS活性，可以將其應用到電化學和SERS分析領域。
　　2.首次提出將金納米樹脂復合微球固載在經硫堇處理的玻碳電極表面，通過硫堇電化學信

4、號的改變，發(fā)展了一種檢測癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)的新方法。其特點在于:第一，金納米樹脂復合微球具有比表面積大的特點，可以有效增大電極的表面積并提高CEA抗體(CEA antibody, anti-CEA)的固載量。第二，金納米樹脂復合微球表面含有豐富的活性基團，anti-CEA不僅可以通過蛋白質分子上氨基或巰基與金形成金氮鍵或金硫鍵而將anti-CEA共價吸附在工作電極表面，而且還可以通過復合

5、微球與蛋白質分子上的羧基氨基發(fā)生縮合反應而固定抗體，進一步提高anti-CEA的固載量。第三，金納米樹脂復合微球的導電性能強，可以提高電活性物質與電極之間的電子傳遞速率，提高該免疫傳感器的檢測靈敏度。實驗結果表明，該免疫傳感器制作方法簡單，固化抗體分子保持良好，靈敏度高，抗干擾性強，可用于CEA的分析檢測。
　　3.基于普魯士藍(Prussian blue，PB)和甲苯胺藍(Toluidine blue，TB)不同的電化學活性，將

6、PB和TB修飾到金納米樹脂復合微球表面，發(fā)展了一種基于電化學分析技術同時檢測兩種肺癌標志物-CEA和神經烯醇化酶(Neuronal specific enolase，NSE)的生物傳感新方法。本研究使用一種氟摻雜氧化錫(Fluorine-doped tin oxide，F(xiàn)TO)導電玻璃作為工作電極，通過氨基功能化使工作電極表面形成一層富含氨基的膜，進一步將PB和TB修飾的金納米樹脂復合微球分別固定到工作電極上，隨后anti-CEA和神經

7、烯醇化酶抗體(NSE antibody，anti-NSE)共價吸附在工作電極上，制得一種同時檢測CEA和NSE的電化學免疫傳感器。本實驗對制備PB和TB修飾的金納米樹脂復合微球及其標記的免疫傳感器做了電化學表征，并對免疫傳感器的實驗條件進行優(yōu)化。在最優(yōu)化條件下，該免疫傳感器檢測CEA和NSE的最低檢測限分別是0.11 ng/mL和0.08 ng/mL。
　　4.為了避免信號分子發(fā)生氧化還原反應和提高檢測的穩(wěn)定性，基于納米結構的SE

8、RS效應，利用拉曼信號分子在金納米樹脂復合微球表面吸附，發(fā)展一種基于SERS技術檢測一種或兩種肺癌標志物的新方法。本研究將生物相容性好的殼聚糖穩(wěn)定的金納米顆粒固定在基底表面，用于捕獲抗體的固載，可有效保持其生物活性。利用金納米樹脂復合微球的大比表面積，可提高標記抗體的固載量及其與識別抗原的結合效率，將信號分子(尼羅藍A，Nile blue A，NBA)和標記抗體修飾到金納米樹脂復合微球表面形成標記探針。本研究成功構建了一個雙抗夾心式SE

9、RS免疫探針來檢測溶液中CEA的濃度。同時，利用兩種具有可區(qū)分SERS特征峰的拉曼信號分子(4-巰基苯甲酸和NBA)，構建一個可以同時檢測兩種肺癌標志物的SERS免疫探針。
　　5.提出了一種基于金納米樹脂復合微球雙模式、高通量檢測肺癌標志物的方法，并用電化學和SERS系統(tǒng)地表征檢測信號的變化。經過一系列的篩選，選擇兩種具有可區(qū)分的電化學和SERS特征峰的硫堇和NBA，將其標記到金納米樹脂復合微球上構建一個電化學和SERS雙模式的

10、免疫傳感器，實現(xiàn)了對CEA和細胞角蛋白19片段(Cytokeratin19fragment，CK-19)的定量檢測。采用雙抗夾心法，標記探針、目標抗原和捕獲探針通過抗體-抗原-抗體特異性免疫反應形成免疫復合物。當免疫復合物形成后，就可以將其放置于電化學工作站或者拉曼光譜儀下進行電化學或SERS檢測。免疫傳感器在電化學模式下可以檢測到CEA和CK-19的最低濃度分別為0.01 ng/mL和0.04 ng/mL;在SERS模式下檢測到CEA