三株大型真菌的發(fā)酵條件優(yōu)化及其胞外多糖的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、關(guān)于真菌多糖的研究方興未艾，部分珍稀的野生大型真菌不斷有相關(guān)研究與報(bào)道，銀杏多孔菌(Fomitopsis sp.)、小孔硬孔菌[Rigidoporus microporus(Fr.)Overh.]、大肉齒耳菌(Steccherinum septentrionale(Fr.)Bank.)三株野生大型真菌，在液體發(fā)酵及胞外多糖結(jié)構(gòu)與功能研究方面，尚未有相關(guān)報(bào)道。本課題以這三株大型真菌為研究對(duì)象，在分子生物學(xué)水平上對(duì)采集于長(zhǎng)白山山脈的銀杏多孔

2、菌進(jìn)行了菌株鑒定，并對(duì)三株真菌進(jìn)行了搖瓶與液體深層發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，收集了胞外粗多糖，純化處理得到精制多糖，通過傅里葉紅外變換、氣相色譜、熱重、剛果紅及特異性粘度實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)手段，預(yù)測(cè)了多糖分子的結(jié)構(gòu)與組成，通過DPPH法、鄰二氮菲法進(jìn)行了胞外多糖抗氧化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如下:
　　1、種屬鑒定
　　采用ITS技術(shù)，對(duì)銀杏多孔菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。將獲得的ITS基因序列提交至NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.

3、nlm.nih.gov/)，獲得基因序列號(hào):KF279536。通過對(duì)包含銀杏多孔菌在內(nèi)的這些ITS序列進(jìn)行初步比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果證實(shí)該大型真菌屬于擬層孔菌屬。
　　2、液體深層發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
　　搖瓶發(fā)酵，確定了三株大型真菌最優(yōu)發(fā)酵條件，銀杏多孔菌（Ginkgo polypores）:周期8d，乳糖、酵母浸粉分別作為C源、N源;小孔硬孔菌[Rigidoporus microporus(Fr.)Overh.]:周期6d、C

4、源為乳糖、N源為胰蛋白胨;大肉齒耳菌(Steccherinum septentrionale(Fr.)Bank.):周期8d、麥芽糖與大豆粉分別為C、N源。在此基礎(chǔ)上，通過5L三聯(lián)罐液體深層發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，初步探索了三株大型真菌在液體發(fā)酵條件下胞外多糖與菌絲干重、顯微形態(tài)特征及流變學(xué)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲球形態(tài)學(xué)與流變學(xué)存在相互影響、相互制約的關(guān)系。
　　3、胞外多糖的純化、結(jié)構(gòu)與功能研究
　　通過過濾、醇沉收集胞外粗多糖，再經(jīng)Sev

5、age法除蛋白、Sepharose CL-6B凝膠柱層析，獲得精多糖。(1)紅外分析表明，除了典型的多糖吸收峰外，銀杏多孔菌胞外多糖存在吡喃環(huán)和羧酸基團(tuán);小孔硬孔菌胞外多糖存在α和β糖苷鍵;大肉齒耳菌存在β-葡萄糖醛酸及甘露糖結(jié)構(gòu)。(2)氣相分析表明，銀杏多孔菌胞外多糖主要由吡喃甘露糖(59.32％)、吡喃半乳糖(12.71％)和葡萄糖(11.02％)組成;小孔硬孔菌單糖組成為葡萄糖(50.09％)、甘露糖(28.53％)和半乳糖(15

6、.83％);大肉齒耳菌胞外多糖主要由葡萄糖組成，占比98.05％。(3)通過熱重分析實(shí)驗(yàn)可知，三株大型真菌胞外多糖在低于101℃、112.11℃和132.49℃的溫度下，能較好的保持生物學(xué)活性。(4)剛果紅實(shí)驗(yàn)，小孔硬孔菌胞外多糖可以與剛果紅形成絡(luò)合物，證明其高級(jí)結(jié)構(gòu)中存在三股螺旋的無(wú)規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象，而銀杏多孔菌與大肉齒耳菌胞外多糖不存在這一結(jié)構(gòu)。(5)烏氏粘度計(jì)測(cè)定胞外多糖的特異性粘度，發(fā)現(xiàn)銀杏多孔菌、小孔硬孔菌及大肉齒耳菌胞外多糖的特

7、異性粘度分別為274mL/g、334mL/g及543mL/g。(6)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，三種大型真菌胞外多糖都有一定的抗氧化活性，但差異也較顯著，銀杏多孔菌胞外多糖對(duì)DPPH清除率較低，多糖濃度為2.5mg/mL時(shí)，DPPH清除率為10.02％，但對(duì)·OH自由基清除率較高，在4mg/mL時(shí)·OH自由基清除率達(dá)到37.99％;小孔硬孔菌對(duì)DPPH與·OH自由基清除率均較低，分別為8.75％和4.37％;大肉齒耳菌胞外多糖對(duì)DPPH、·OH