氧化還原聚合包埋乙烯基化脂肪酶及性能研究.pdf

1、本文采用乙烯基化和氧化還原聚合兩步法包埋脂肪酶，從多方面考察包埋酶的水相和有機(jī)相催化性能，并將底物誘導(dǎo)技術(shù)與聚合包埋相結(jié)合，研究底物誘導(dǎo)對(duì)包埋酶催化活性的影響。
　　 包埋脂肪酶的制備：①N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(NAS)作修飾劑，與酶表面的伯氨基反應(yīng)完成乙烯基化。當(dāng)脂肪酶與NAS的摩爾比約為1:114，反應(yīng)時(shí)間為45min時(shí)獲得最大程度的乙烯基化，其修飾度為94.8％。②單體：聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯(A)、聚乙二醇200

2、二丙烯酸酯(B)、聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯(C)或聚乙二醇400二丙烯酸酯(D)，在N，N，N′，N′-四甲基乙二胺/過硫酸銨引發(fā)下，對(duì)乙烯基化脂肪酶進(jìn)行氧化還原聚合，得到四種包埋酶。脂肪酶與單體的配比是影響包埋效果的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)脂肪酶液/單體=2.5/1(V:V)時(shí)包埋酶獲得最大活性收率，并且四種包埋酶的蛋白負(fù)載率都超過96%。聚合反應(yīng)的溫度要控制在30℃，低溫聚合保證了包埋酶的活性。
　　 在考察包埋酶的水相催

3、化性能時(shí)，四種包埋脂肪酶LIP-A、LIP-B、LIP-C和LIP-D的活性收率分別為29.8%、32.3%、39.2%和41.6%。由于酶與載體的多點(diǎn)共價(jià)連接，所以包埋酶的pH、熱和儲(chǔ)藏時(shí)間等穩(wěn)定性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過游離酶。在強(qiáng)酸(pH=2.4)、強(qiáng)堿(pH=11.5)和高溫(80℃)環(huán)境中，游離酶幾乎完全失活，但四種包埋酶的殘余活力分別達(dá)到19.4%、42.0%和10%以上。用沉淀變性劑和溶解變性劑浸泡包埋酶30d，其殘余活性仍分別保留在2

4、2.2％和17.5％以上。包埋酶經(jīng)重復(fù)使用10次后仍殘余83.2%以上的初始活力；置于4℃儲(chǔ)藏60d之后，其殘余活力為89.1%以上。
　　 有機(jī)相中，包埋酶LIP-D的最佳催化溫度是40℃。該溫度下催化酯化反應(yīng)在24h時(shí)達(dá)到平衡，此時(shí)LIP-D的酯化轉(zhuǎn)化率為37.4%。水可以有效提高LIP-D的酯化活性，在含水量為2%(v/v)時(shí)，包埋酶的酯化轉(zhuǎn)化率最高，其活性為無水體系的1.29倍。LIP-D包埋酶在循環(huán)使用5次后其活性損失

5、僅有8.75%，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。
　　 采用月桂酸、正丁醇、椰油酰胺丙基甜菜堿（CAB35）、月桂基咪唑啉、月桂酸+CAB35和月桂酸+咪唑啉六種配體誘導(dǎo)包埋酶。六種底物誘導(dǎo)包埋酶的酶活較無底物誘導(dǎo)的包埋酶都有了不同程度的提高，其中尤以月桂酸+CAB35和月桂酸+咪唑啉兩組雙底物誘導(dǎo)的包埋酶的酶活提高最為顯著，其活性收率分別為無底物誘導(dǎo)包埋酶活性的161.4%和237.3%。底物誘導(dǎo)還增強(qiáng)了包埋酶pH、熱和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，并且不