海洋微擬球藻microRNA測序鑒定及其轉(zhuǎn)基因體系的建立.pdf

1、microRNA(miRNA)是細(xì)胞內(nèi)源性的、由莖環(huán)結(jié)構(gòu)經(jīng)剪切產(chǎn)生的、長度在～22nt的單鏈RNA,它通過與靶標(biāo)mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)降解靶標(biāo)mRNA或抑制翻譯過程,參與基因的表達(dá)調(diào)控。它廣泛存在于人、動(dòng)物、植物和病毒中,與人類疾病、動(dòng)物生長發(fā)育、植物抗逆等過程密切相關(guān)。miRNA的研究目前在動(dòng)植物中較為深入,在單細(xì)胞微藻中研究相對(duì)較少,僅在萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)和三角褐指藻(Phaeodactylu

2、m tricornutum)中有見報(bào)道。微擬球藻(Nannoehloropsis oceanica)屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae),微擬球藻屬(Nannochloropsis),該藻富含EPA,有望成為EPA生產(chǎn)的原料。此外,該藻油脂含量達(dá)到干重的30％以上,可作為能源微藻良好的候選藻種。
　　本研究以海洋微擬球藻(Nannochloropsis oceanica)為實(shí)驗(yàn)材料,通過Solexa高通量測序首次鑒

3、定了該藻中的miRNA,并建立了該藻的遺傳轉(zhuǎn)化體系,旨在海洋微擬球藻中實(shí)現(xiàn)利用人工設(shè)計(jì)的miRNA進(jìn)行基因沉默奠定基礎(chǔ)。本研究包括如下二個(gè)部分:
　　第一部分,提取海洋微擬球藻的總RNA,分離其中小于200bp的小RNA,通過在小RNA的兩端加上人工接頭,構(gòu)建了小RNA的cDNA文庫,應(yīng)用Solexa高通量測序,獲得了數(shù)百萬條小RNA序列,剔除tRNA、rRNA和可能的mRNA碎片,共獲得近2000條疑似miRNA序列,其中76％

4、的序列長度集中在20-22nt。將測得的序列分別與已經(jīng)報(bào)道的和海洋微擬球藻基因組進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)有37條序列與已經(jīng)報(bào)道的其他物種的miRNA相似性較高,相似度均達(dá)90％以上;2條序列與已知同源性較低,但是與已知的兩條miRNA的前體序列幾乎匹配,且與該藻基因組能夠完全匹配,而這2條序列在基因組的上下游序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),因此推測這2條序列可能為新的miRNA;1074條序列與已知的miRNA或miRNA的前體序列相似度很低,但與基因組的相

5、應(yīng)序列可完全匹配,推測這組序列可能是海洋微擬球藻中特異性表達(dá)的miRNA。進(jìn)一步分析表明,測序獲得的miRNA的5’端具有對(duì)U堿基的偏好性,這一現(xiàn)象與已經(jīng)報(bào)道的其他物種的miRNA相似。
　　遺傳轉(zhuǎn)化體系建立是利用人工設(shè)計(jì)的miRNA進(jìn)行基因沉默的平臺(tái)和基礎(chǔ)。本研究第二部分構(gòu)建了海洋微擬球藻的轉(zhuǎn)基因體系。以pMS188和pCB801為基礎(chǔ)質(zhì)粒,成功構(gòu)建了同時(shí)含有抗性基因ble和多克隆位點(diǎn)的新載體pCJ901,進(jìn)一步在多克隆位點(diǎn)中插