蚯蚓纖溶蛋白的分離純化及其對MCF-7細胞生長、粘附影響的研究.pdf

1、蚯蚓，又名地龍，是我國傳統(tǒng)中藥材之一，具有活血化瘀、痛經(jīng)活絡(luò)之功效。1983年日本學者從蚯蚓體內(nèi)分離得到了一組具有纖維蛋白溶解能力的酶類物質(zhì)，并將之命名為蚓激酶，視之為一種新型溶栓藥物。自此，關(guān)于蚯蚓藥理活性組分的研究越來越受到科研工作者的關(guān)注。隨著對其藥理作用研究的深入，蚯蚓抗腫瘤作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，但以往關(guān)于蚯蚓抗腫瘤活性的研究多集中于其粗提取物的抑制腫瘤生長的作用，我們的前期預(yù)實驗也表明其提取物確實可以抑制腫瘤細胞生長，而且其鹽析

2、產(chǎn)物除抑制腫瘤細胞生長外還可以降低細胞粘附性。因此，本文以赤子愛勝蚓為原料，以人乳腺癌MCF-7細胞株為研究對象，對新鮮赤子愛勝蚓體內(nèi)的抗腫瘤活性蛋白成分進行了分離純化以及鑒定，以篩選活性最強的蛋白組分，并探索其抗腫瘤細胞粘附的作用機制以及與紫杉醇聯(lián)合使用后的抗腫瘤作用的變化，具體實驗過程及結(jié)果見下文:
　　1、蚯蚓抗腫瘤蛋白(EFP)的分離純化及鑒定。
　　實驗以CCK-8法來檢測蚯蚓提取物作用于MCF-7細胞后的細胞存活

3、率，并結(jié)合得率來篩選抗腫瘤活性較高的蛋白成分。分離純化過程為:制備勻漿，取上清液進行飽和硫酸銨分級鹽析，細胞實驗篩選各級蛋白沉淀抗腫瘤活性，然后經(jīng)DEAE陰離子交換層析，S200凝膠層析，G10脫鹽等過程得到一個具有較強抗腫瘤活性的單一蛋白，即EFP。
　　對該蛋白進行性質(zhì)檢測，電泳分析得到其分子量在25kDa左右，纖維蛋白平板實驗顯示EFP具有非常強的纖維蛋白溶解作用，經(jīng)北京華大蛋白質(zhì)研究中心檢測，LC-MS等結(jié)果顯示，EFP與

4、赤子愛勝蚓纖溶酶A(Q8MX72)具有高度相似性。
　　2、EFP的抗腫瘤活性以及抗粘附機制研究
　　采用CCK-8法檢測EFP的抑制MCF-7細胞生長的能力，結(jié)果表明EFP可以顯著抑制MCF-7細胞的生長存活，作用弱于紫杉醇。劃痕實驗結(jié)果表明，EFP可以顯著抑制MCF-7細胞的生長遷移。此外，實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，EFP具有較強的抗細胞粘附作用，經(jīng)RT-PCR以及WesternBlot檢測粘附因子FAK、CD44v6的表達，結(jié)

5、果發(fā)現(xiàn)，EFP可以顯著下調(diào)FAK、CD44v6在mRNA以及蛋白質(zhì)水平的表達，這表明EFP的抗細胞粘附作用可能與下調(diào)FAK、CD44v6的表達有關(guān)。
　　3、EFP與紫杉醇聯(lián)合使用后抗腫瘤細胞活性的檢測
　　使用CCK-8法檢測EFP與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用之后抗腫瘤活性的變化，結(jié)果表明，二者聯(lián)合使用具有協(xié)同效果，紫杉醇的活性顯著增強。采用免疫熒光法檢測EFP與紫杉醇單獨使用以及聯(lián)合使用時MCF-7細胞內(nèi)β-tublin的變化，結(jié)果

6、表明，單獨使用EFP對β-tublin并無明顯作用，而聯(lián)合使用組與單用紫杉醇組β-tublin的變化也無顯著差異，這表明EFP不能增強紫杉醇抑制微管蛋白解聚的能力。
　　綜上所述，EFP，即蚯蚓纖溶酶A，具有抑制MCF-7細胞生遷移、抗細胞粘附的作用，而且EFP還可以下調(diào)FAK、CD44v6的表達。與紫杉醇聯(lián)合使用后，作用強度增加，而且該增強作用與EFP增加紫杉醇抑制微管蛋白解聚的能力無關(guān)。
　　本文對蚯蚓抗腫瘤活性蛋白EF