人凝血因子Ⅷ生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的近紅外定量分析研究.pdf

1、人凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ，F(xiàn)Ⅷ)是治療甲型血友病和獲得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血癥狀等的不可或缺的藥品，但我國(guó)當(dāng)前整個(gè)血液制品行業(yè)長(zhǎng)期處于供不應(yīng)足的狀態(tài)，因此提高產(chǎn)品的活性收率以及比活性是解決現(xiàn)狀的一個(gè)必要舉措。國(guó)內(nèi)FⅧ的生產(chǎn)過(guò)程多采用離子交換層析法，從人血漿冷沉淀中分離純化FⅧ，包括酸沉淀、A50吸附、S/D滅活、層析、超濾、凍干等主要環(huán)節(jié)，由于缺乏很好的過(guò)程控制方法，導(dǎo)致產(chǎn)品收率低、比活低。因此，有必要針

2、對(duì)生產(chǎn)現(xiàn)狀，將現(xiàn)代過(guò)程分析與控制技術(shù)引入到FⅧ生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)當(dāng)中，增加對(duì)生產(chǎn)工藝過(guò)程的了解，有效控制工藝過(guò)程，提升FⅧ的收率及比活性。近紅外光譜分析技術(shù)(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)是當(dāng)前最重要的一種過(guò)程分析技術(shù)（Process Analytical Technology，PAT），具有快速準(zhǔn)確無(wú)損等優(yōu)勢(shì)，在制藥行業(yè)中已有較為廣泛的應(yīng)用，在血液制品中的應(yīng)用也有研究。
　　本課題選取FⅧ生產(chǎn)

3、過(guò)程中的酸沉淀、層析洗脫和凍干環(huán)節(jié)為研究對(duì)象，采用NIRS結(jié)合不同的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，嘗試建立了針對(duì)FⅧ比活性、效價(jià)以及水分的定量分析模型，為其在線應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.FⅧ酸沉淀過(guò)程分析和近紅外定量模型的建立
　　本實(shí)驗(yàn)考察了人凝血因子Ⅷ生產(chǎn)過(guò)程中酸沉淀終點(diǎn)控制方法的合理性，然后用近紅外光譜分析技術(shù)建立了FⅧ比活性的偏最小二乘(partial least squares，PLS)定量分析模型

4、，選取了測(cè)定過(guò)一級(jí)數(shù)據(jù)的108個(gè)樣品光譜參與建模，其中隨機(jī)選取6次試驗(yàn)的64個(gè)樣品劃入校正集，另外4次試驗(yàn)的44個(gè)樣品劃入驗(yàn)證集，通過(guò)對(duì)校正集樣品和驗(yàn)證集樣品的含量分布以及主成分得分圖進(jìn)行分析，證明分類(lèi)結(jié)果比較理想，滿足樣品集的劃分要求。通過(guò)對(duì)校正集樣品的統(tǒng)計(jì)分析，將杠桿值或?qū)W生化殘差值過(guò)高的樣品進(jìn)行判斷，若確為異常樣品則予以剔除。在光譜測(cè)量過(guò)程中不可避免地會(huì)引入噪聲和產(chǎn)生基線漂移，在建立校正模型前有必要對(duì)光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，微分可以

5、有效消除基線的漂移，放大信號(hào)差異，平滑多與微分聯(lián)用，可有效提高信噪比，標(biāo)準(zhǔn)化(Autoscale)可以賦予光譜中所有波長(zhǎng)的變量相同的權(quán)重，凸顯樣品光譜的差異，最終選擇這3種預(yù)處理方法——一階微分+SG13點(diǎn)平滑+標(biāo)準(zhǔn)化，采用處理后的光譜數(shù)據(jù)建立PLS校正模型，模型的各項(xiàng)參數(shù)較為理想，Rc=0.9649，Rp=0.9229，RMSEC=0.0576，RMSEP=0.0493。對(duì)建立好的模型進(jìn)行預(yù)測(cè)精密度的考察，在驗(yàn)證集樣品中隨機(jī)選取3個(gè)樣

6、品，包含不同的FⅧ比活性值，重復(fù)測(cè)量6次光譜，然后采用建立的模型通過(guò)采集光譜得到樣品的預(yù)測(cè)值，經(jīng)計(jì)算預(yù)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5％左右，且隨著比活的升高而減小，證明此分析方法具有較好的重復(fù)性，可用于未知樣品的預(yù)測(cè)。
　　2.人凝血因子Ⅷ層析過(guò)程中洗脫液效價(jià)的近紅外定量分析研究
　　本實(shí)驗(yàn)建立了FⅧ層析過(guò)程中洗脫液FⅧ效價(jià)的定量模型。層析洗脫過(guò)程獲得了68個(gè)樣品，F(xiàn)Ⅷ效價(jià)分布比較均勻，符合樣品集的要求，且不存在顯著異常點(diǎn)。比較不同

7、方法的PLS建模結(jié)果可知，選擇中心化(Meancenter)+基因算法（Genetic algorithm，GA）所建立的PLS模型R2為0.9010、RMSEP為0.4090，既有較高的線性，也降低了預(yù)測(cè)誤差，它是所使用的最佳PLS建模方法。而采用ANN、SVM方法建立模型，其結(jié)果表明采用sigmoid傳輸函數(shù)的BP-ANN建模方法的R2=0.942，RMSEC=0.3754，RMSEP=0.4272，是所有方法中最佳的建模方式。這可

8、能是因?yàn)镕Ⅷ的效價(jià)是物質(zhì)的活性信息，較為復(fù)雜，與物質(zhì)的濃度不成定量線性關(guān)系，所以采用非線性的回歸方法能夠得到更好的建模結(jié)果。應(yīng)用近紅外光譜分析技術(shù)和此定量模型，可以在FⅧ層析洗脫過(guò)程中針對(duì)FⅧ效價(jià)進(jìn)行特異性監(jiān)測(cè)，從而更準(zhǔn)確的控制收集洗脫液的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
　　3.人凝血因子Ⅷ冷凍干燥過(guò)程中水分含量的近紅外定量分析研究
　　本實(shí)驗(yàn)利用近紅外光譜和相關(guān)的化學(xué)計(jì)量學(xué)建立了FⅧ凍干過(guò)程中水分含量的定量檢測(cè)模型，通過(guò)考察不同的預(yù)處理方法

9、和光譜區(qū)間選擇方法，最終確定了正交信號(hào)校正(OSC)結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)加SG平滑的預(yù)處理方法，以及GA作為譜區(qū)選擇方法。所建立模型的主要參數(shù)為R2=0.918，RMSEC=0.2141，RMSECV=0.4102，RMSEP=0.3848，均處于可以接受的范圍內(nèi)。通過(guò)驗(yàn)證，模型的線性、分辨能力、準(zhǔn)確度和精密度等均符合要求，證明了該模型的實(shí)用性與有效性。該模型的建立，是實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)凍干過(guò)程中FⅧ制劑水分含量變化的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，一旦在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)得以實(shí)