DNA和石英晶體微天平為基的傳感平臺的構(gòu)建及其在靶定生物分子和環(huán)境檢測中的應(yīng)用.pdf

1、本論文的工作分為三部分，第一部分是關(guān)于針對河豚體中河蚌毒素快捷方便檢測方法的研制;第二部分是關(guān)于石英晶體微天平的傳感平臺的建立以擴大儀器應(yīng)用范圍，針對生物小分子腺苷的檢測方法的確立和藍藻爆發(fā)時對藻毒素吸附材料表面設(shè)計提出建議;第三部分是基于納米金的SPR效應(yīng)所產(chǎn)生的顏色變化與具有pH響應(yīng)的多聚腺嘌呤DNA分子進行結(jié)合，構(gòu)建具有pH響應(yīng)的可視化傳感器。
　　 傳感器是將對靶定分子具有特異性識別作用的識別元件與一些信號轉(zhuǎn)換或放大元件

2、相結(jié)合的分析工具。生物傳感器則是對生物分子具有響應(yīng)的傳感器或者識別元件自身就是具有生物活性的材料如蛋白質(zhì)（酶、抗原、抗體、）、DNA和生物膜等。近年來隨著社會發(fā)展，人們對于食品安全和環(huán)境健康的問題越來越關(guān)注，對此類問題的檢測手段的研制也是科研一個比較集中的課題。對于環(huán)境和食品檢測，一些大型儀器可以提供很高的精密度但由于其價格昂貴、操作復(fù)雜、需要專人培訓(xùn)操作而使得這些大型儀器在日常生活和生產(chǎn)中的應(yīng)用有很大的限制。因此開發(fā)一些操作簡單容易制

3、備且成本低廉的傳感器可以有效提高公眾在日常生活中對有毒有害物質(zhì)的提前防護意識，同時由于操作方便不需培訓(xùn)而使大眾更容易接受。在我碩博期間，我只要集中在對操作簡單、制備方便的生物傳感器的方法研究以使得任何沒有專業(yè)知識背景的群眾都可以操作;同時還對石英晶體微天平為基的傳感平臺的建立進行研究。
　　 河蚌毒素是一種具有生物富集作用的天然神經(jīng)毒素。其可以通過阻礙鈉泵運行而使人體內(nèi)鈉鉀失衡導(dǎo)致人體癱瘓甚至死亡。這種毒素在水生物體中無法發(fā)揮毒

4、副作用主要是由于水生物體中的鈣泵作用更重要。由于這種毒素穩(wěn)定性好因此無法通過簡單殺菌消毒或者高溫烹飪?nèi)コ乙坏┦橙胫卸緞t無解藥可救，因此對此毒素在未食用前的檢測有很重大的意義。現(xiàn)在研發(fā)出的針對河蚌毒素的檢測方法有七種，但是這些方法由于受到儀器復(fù)雜、動物實驗的道德問題、生物提取物難度大、抗體穩(wěn)定性差等的問題而不能大規(guī)模生產(chǎn)日常生活應(yīng)用。我們通過研究此毒素結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)河蚌毒素結(jié)構(gòu)中含有兩個背靠背的胍基團，這種基團與DNA結(jié)構(gòu)中的鳥嘌呤很相似

5、，我們懷疑這種結(jié)構(gòu)的相似性會影響有鳥嘌呤參與的一些結(jié)構(gòu)形成比如G四聯(lián)體的形成。通過圓二色譜我們發(fā)現(xiàn)河蚌毒素的存在會顯著延緩-四聯(lián)體的形成且G-四聯(lián)體的量會減少，同時加入越多的河蚌毒素會誘導(dǎo)G-四聯(lián)體的結(jié)構(gòu)形成更少。而這種阻礙G-四聯(lián)體形成的現(xiàn)象在其他類似物如具有線型胍基團的精氨酸、鹽酸胍中則沒有觀察到。除了結(jié)構(gòu)的研究，我們還進行的熱力學(xué)方面的研究。利用等溫滴定微量熱儀，我們觀察到DNA分子與河蚌毒素和其他類似物之間的結(jié)合比和結(jié)合常數(shù)，發(fā)

6、現(xiàn)河蚌毒素與DNA分子的結(jié)合相比于其他類似物更強但弱于DNA與鉀離子之間的作用，很好的解釋了河蚌毒素可以阻礙和干擾G-四聯(lián)體的形成但卻不能使所有DNA分子處于單鏈狀態(tài)。通過比較河蚌毒素及類似物與DNA之間相互作用發(fā)現(xiàn)，河蚌毒素與DNA的結(jié)合常數(shù)是其他兩種類似物的5到10倍，解釋了河蚌毒素可以干擾G-四聯(lián)體的形成而類似物則不具有這種性質(zhì)。利用圓二色譜和等溫滴定微量熱儀得出的結(jié)論，我們認為通過檢測有毒素存在的DNA體系中G-四聯(lián)體的量可以間

7、接的測定體系中毒素的含量。我們采用了一個廣泛應(yīng)用且價格低廉的染料結(jié)晶紫作為熒光信號分子，有研究組報道此染料可以識別G-四聯(lián)體和單鏈DNA因此可以作為一個很好的信號傳導(dǎo)分子。我們發(fā)現(xiàn)此分子在與單鏈DNA結(jié)合時會熒光增強，因此當有毒素存在而使部分DNA不能形成G-四聯(lián)體時，結(jié)晶紫可以與DNA結(jié)合熒光增強而達到對毒素檢測的熒光增強效果。
　　 石英晶體微天平是利用石英震動時有固有的震動頻率，震動頻率會由于片子表面有吸附或修飾而產(chǎn)生變化

8、，通過對片子震動時頻率和耗散的變化可以達到對片子表面吸附材料的質(zhì)量和性質(zhì)測定的目的。因此儀器在使用初期經(jīng)常用于吸附和機理研究，但用此儀器進行檢測分析研究的則很有限。在本人碩博期間，由于檢測的分子均為小分子，因此一直在考慮如何將此儀器應(yīng)用于對小分子的檢測中。通過DNA適配體對于生物小分子腺苷特異性識別作用和納米金大的質(zhì)量，利用DNA互補配對，當有小分子目標物存在時，由于DNA結(jié)合目標物而產(chǎn)生構(gòu)象變化不能再與負載納米金的配對鏈相結(jié)合，而沒有

9、目標物時負載納米金的配對鏈可以配對到芯片表面而產(chǎn)生很大的頻率信號。通過這種方法可以有效改善傳統(tǒng)不能檢測小分子的一個關(guān)鍵問題:即當小分子存在時由于小分子分子量小而產(chǎn)生很小的信號變化。通過納米金的擴增，存在的小分子越少可以負載上去的納米金就越多，那么信號就越大，從而使得對小分子的低限檢測成為可能，且由于信號得到很大增強而使信號識別和數(shù)據(jù)處理更加方便。同時利用DNA分子可逆互補配對我們也達到了對芯片表面反復(fù)利用的目的。
　　 夏天時藍

10、藻爆發(fā)時產(chǎn)生的惡臭和水體中的藻毒素的去除是我們關(guān)系的問題之一。常用的去除吸附材料是活性炭。我們考慮到現(xiàn)在塑料產(chǎn)生的污染很大，如果可以通過對塑料表面進行改性，可以同時達到對水體中藻毒素吸附的去除和變廢為寶清潔環(huán)境雙贏的目的。我們以比較常用的樹脂材料聚苯乙烯作為本體進行吸附材料設(shè)計的研究。由于藻毒素是一種具有等電點的非蛋白質(zhì)毒素，其受環(huán)境pH的影響很大，在不同的pH會顯現(xiàn)不同的電性。通過對聚苯乙烯表面基團設(shè)計，我們合成了聚苯乙烯樹脂、季銨化

11、聚苯乙烯和磺化聚苯乙烯三種具有不同電性的聚苯乙烯基體。通過旋涂將三種不同基底涂敷于石英晶體微天平的芯片上，利用儀器進行在線檢測吸附過程。通過實驗發(fā)現(xiàn)在中性水域，季銨化聚苯乙烯有最好的對于藻毒素的吸附效果，此結(jié)論可以作為以后對廢棄塑料改性的一個理論依據(jù)。
　　 除了研制簡單制各的熒光傳感器，可視化傳感器的研制也是我的一個研究課題。利用納米金距離不同產(chǎn)生不同顏色的特點，將其與具有pH響應(yīng)性的DNA分子相結(jié)合，達到了對特定pH范圍檢測