利用纖維素及木糖的重組假單胞菌的構(gòu)建和PHA發(fā)酵研究.pdf

1、本室從土壤中分離得到的PseudomonasmendocinaNK-01能從葡萄糖出發(fā)合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)和褐藻寡糖并完成了全基因組測(cè)序。但該菌不能利用纖維素及其降解物為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。隨著日益嚴(yán)重的環(huán)境污染問題及能源與糧食危機(jī)，研究和開發(fā)利用自然界存儲(chǔ)量最大的纖維素及其降解物為底物進(jìn)行生物合成具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在P.mendocinaNK-01構(gòu)建纖維素及木糖代謝途徑，使其能從纖維素及木糖出發(fā)合成P

2、HA。
　　本研究首先克隆了來自Cellulomonas fimi ATCC484的葡聚糖內(nèi)切酶基因（cenA）和來自Ruminococcus albus ATCC27210的β-葡糖苷酶基因(bgl)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒p33-NC-cenA、pBBR-bgl，并分別在NK-01中進(jìn)行表達(dá)。葡聚糖內(nèi)切酶CenA能有效降解羧甲基纖維素，總酶活力達(dá)到22.36U/mL，其中40.3％的酶分泌到培養(yǎng)基中;β-葡糖苷酶酶活力達(dá)到236mU/m

3、L，在以纖維二糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中能有效降解纖維二糖。
　　其次，本研究構(gòu)建了cenA基因的整合型載體pEX-upp-PNCP，成功將cenA基因整合進(jìn)了NK-01基因組的phaZ（編碼PHA解聚酶）位點(diǎn)，構(gòu)建了cenA基因整合型表達(dá)的菌株P(guān).mendocina NK-01NCP。兩步法發(fā)酵PHA結(jié)果表明，cenA基因的插入沒有影響目的產(chǎn)物PHA的合成，PHA含量為12.2％，與野生菌相似(12.8％)。將表達(dá)質(zhì)粒pBBR-bg

4、l轉(zhuǎn)入工程菌P.mendocina NK-01NCP，成功構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶和β-葡糖苷酶的工程菌P.mendocina NK-01NCPB。另外，本研究同時(shí)構(gòu)建了bgl基因的整合型載體pEX-upp-AB，旨在將bgl基因整合進(jìn)algA（甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶）位點(diǎn)。為今后的工程菌構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
　　在檢測(cè)分析P.mendocina NK-01基因組的木糖相關(guān)基因，即:木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶基因的轉(zhuǎn)錄水平