基于酶擴(kuò)增的新型銀納米簇合成方法的構(gòu)建及其生物傳感應(yīng)用.pdf

1、近幾年，以DNA為模板合成的銀納米簇(DNA-AgNCs)在生物傳感及成像領(lǐng)域吸引了越來越多科學(xué)家的關(guān)注。由于量子產(chǎn)率高、抗光漂白性強(qiáng)及細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，DNA-AgNCs已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的設(shè)計(jì)中，在生物標(biāo)記及生物成像中也有較多的應(yīng)用。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)是一種特殊的DNA聚合酶。由于其不需要模板的性質(zhì)，TdT在核酸標(biāo)記上已有較多的應(yīng)用。本文基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的擴(kuò)增，開發(fā)出一種新型的DNA-AgNCs合成方法，

2、并將其應(yīng)用于核酸酶的活性檢測及蛋白質(zhì)的分析中。具體如下:
　　1.利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)催化擴(kuò)增單鏈DNA的性質(zhì)，構(gòu)建了一種新型合成DNA-AgNCs的方法。通過TdT在一條不能夠用作DNA-AgNCs合成模板的DNA的3'-OH端擴(kuò)增出一段富含胞嘧啶(C)的DNA序列，然后利用該擴(kuò)增的富C序列成功地合成出了具有熒光性質(zhì)的DNA-AgNCs。另外，我們考察了會影響TdT擴(kuò)增及DNA-AgNCs合成的幾個因素。我們還把以

3、TdT的擴(kuò)增產(chǎn)物DNA-P-Cn作為模板合成的DNA-AgNCs與幾條人工合成的短鏈富C序列作對比，發(fā)現(xiàn)以DNA-P-Cn為模板的DNA-AgNCs的熒光強(qiáng)度要高很多。接著，利用透射電子顯微鏡(TEM)及其附件X射線能譜分析儀(EDS)來對DNA-AgNCs進(jìn)行表征。結(jié)合TEM的結(jié)果，我們推斷長鏈模板合成的DNA-AgNCs熒光更強(qiáng)的原因是因?yàn)?
　　1）.長鏈序列移除AgNCs表面的極性溶劑，更好地保護(hù)AgNCs;
　　2

4、）.AgNC之間存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象。
　　2.基于新型DNA-AgNCs合成方法，我們開發(fā)出了一種末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的活性分析方法。該方法獲得的檢測限(0.0318U)比早前關(guān)于TdT活性檢測的報(bào)道中的低200倍左右，實(shí)現(xiàn)了無標(biāo)記、高靈敏地對TdT酶活進(jìn)行“turn-on”檢測。同時，該方法具有比較穩(wěn)定的重現(xiàn)性，在實(shí)際樣品中的添加回收實(shí)驗(yàn)也取得令人滿意的結(jié)果。最后，我們分析了TdT的幾種常見抑制劑（焦

5、磷酸鈉、金精三羧酸和三磷酸腺苷）的抑制效果。
　　3.基于TdT對隨機(jī)底物的擴(kuò)增及DNA-AgNCs的合成，我們開發(fā)出一種具有普適性的核酸酶“turn-on”檢測方法。我們選取限制性內(nèi)切酶及3'-5'核酸外切酶的典型代表——EcoRⅠ和ExoⅢ作為目標(biāo)分析物。實(shí)驗(yàn)得出，EcoRⅠ的檢測限為0.0629U，ExoⅢ的檢測限為0.00867U，均比相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的要低。此外，對兩種酶檢測的信背比(S/B)分別為30.3及103.2。因

6、此該方法具有很高的靈敏度。由于核酸酶對底物的特異性而具有很好的選擇性。此外，該方法只需要對DNA底物稍作改動，就可以應(yīng)用于切刻酶、DNA連接酶、甲基化酶及堿性磷酸酶等DNA相關(guān)酶類的活性分析中。
　　4.基于凝血酶的核酸適體及切刻酶Nb.BbvCI，我們把新型DNA-AgNCs合成方法應(yīng)用于凝血酶的“turn-on”放大檢測。通過合理地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中涉及的兩條DNA探針——一條核酸適體探針及一條擴(kuò)增探針，我們實(shí)現(xiàn)了高靈敏度地檢測痕量凝