代謝工程技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)均聚物聚3-巰基丙酯的Advenella mimigardefordensis菌株.pdf

1、PTE((p)oly(t)hio(e)ster)是一類人工改造的在碳骨架上含有硫的新型化合物。聚3-巰基丙酸酯(poly(3-mercaptopropionate)，PMP)是PTE聚酯的一種。和結(jié)構(gòu)類似物聚羥基脂肪酸酯(PHA)相比，PTE在主鏈上將氧原子換成了硫原子。因?yàn)檫@種改變，該聚合物具有了一些更有價(jià)值的性質(zhì)，比如其熔點(diǎn)更高，溶解度更低，熱穩(wěn)定性也更高。同時(shí)另一個(gè)吸引人的性質(zhì)是其不可降解性，這些性質(zhì)讓這類聚合物有著很多潛在的用途

2、。隨著不可再生的化石能源的日益枯竭，原本來源于化石原料的聚合物都需要找到合適的替代產(chǎn)品。現(xiàn)代化房屋建造行業(yè)，汽車制造行業(yè)以及其他許多行業(yè)都需要不可降解的聚合物材料，這是PHA這類可降解材料不能滿足的。因此開拓PTE的生物合成方法具有重要意義。
　　 PTE于1951年通過化學(xué)方法首次合成，其后又發(fā)展了多種不同的化學(xué)合成方法，但是化學(xué)方法的難制備，高成本以及低產(chǎn)率的問題制約了PTE的商業(yè)化生產(chǎn);更重要的是這些方法原料基本來源于石油

3、基，面臨著原料日益短缺及環(huán)境污染的諸多問題。使用重組有BPEC代謝途徑(由Clostridiumacetobutylicum的丁酸激酶((B)uk)和磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶((P)tb)以及Thiocapsapfennigii的PHA合成酶Pha(EC)組成）的大腸桿菌菌株實(shí)現(xiàn)了合成均聚物PMP。這種生物法合成的PTE材料相比較于化學(xué)法合成的材料具有單體均一并且聚合度高的優(yōu)點(diǎn)。但該大腸桿菌重組菌只能利用毒性較高的3MP（3-mercaptopr

4、opioante，3-巰基丙酸）為原料合成產(chǎn)物，而不能利用TDP或DTDP等低毒性原料合成PMP，這阻礙了其后期工業(yè)化應(yīng)用。
　　 為了找到一株可以使用DTDP這種低毒性，低成本原料合成PMP的菌種，我們研究組進(jìn)行了大規(guī)模的篩選，最終得到了若干株不同的可以降解DTDP并利用其作為唯一碳源進(jìn)行生長的菌株。對(duì)其中首次鑒定的A.mimigardfordensisDPN7T進(jìn)行了Tn5轉(zhuǎn)座子的突變篩選，全基因組測(cè)序和相關(guān)酶的表達(dá)與酶活測(cè)

5、定，最終發(fā)現(xiàn)和鑒定了一條完整的DTDP降解途徑。該菌對(duì)DTDP降解途徑的第一步是通過硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamidedehydrogenase，LpdA)將其催化變?yōu)?MP，而3MP又是合成PMP的一個(gè)直接前體。
　　 本研究正是利用這株菌作為構(gòu)建合成PMP的基礎(chǔ)菌株。我們首先尋找到了可以在該菌株中穩(wěn)定自主復(fù)制的質(zhì)粒pBBR1MCS5，并嘗試著將BPEC這條唯一已知的可以合成PMP的代謝途徑構(gòu)建到質(zhì)粒pBBR1M

6、CS5上得到了pBBR1MCS5(::)BPEC。但這個(gè)重組質(zhì)粒不能穩(wěn)定的在菌株A.mimigardefordensisSHX1中復(fù)制。出現(xiàn)了抑制菌體生長和質(zhì)粒傳代結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等現(xiàn)象。通過進(jìn)一步的質(zhì)粒構(gòu)建和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，最終確定重組buk-ptb操縱子過表達(dá)是導(dǎo)致這些問題的根源。之后我們發(fā)展了一套適用于該菌株的，利用自殺質(zhì)粒同源雙交換原理進(jìn)行基因敲除或基因替代的方法。利用此方法，將buk-ptb操縱子成功的插入A.mimigardeforde

7、nsis菌株的基因組中，得到了生長正常的菌株和穩(wěn)定遺傳的重組質(zhì)粒。并利用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法定性的證實(shí)了buk-ptb操縱子在被插入到基因組后都可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。3-巰基丙酸雙加氧酶(3-mercaptopropionatedioxygenase，Mdo)是DTDP降解途徑中的第二個(gè)催化酶，該酶催化3MP生成3-亞磺酸基丙酸(3-sulfinopropionate，3SP)，因此該代謝支路會(huì)導(dǎo)致3MP前體底物的減少，是影響PMP產(chǎn)量的關(guān)鍵因素

8、之一。而利用mdo::Tn5突變株進(jìn)行阻斷研究時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)Tn5轉(zhuǎn)座子不穩(wěn)定，并且觀察到因轉(zhuǎn)座導(dǎo)致質(zhì)粒變大的現(xiàn)象。于是我們改用等位替換方法將mdo基因進(jìn)行敲除，發(fā)酵結(jié)果表明敲除了mdo的菌株P(guān)MP產(chǎn)量進(jìn)一步提高。本文研究同時(shí)表明A.mimigardefordesis菌株的常規(guī)碳源葡萄糖酸并不適合用于PMP合成的發(fā)酵碳源。與之相比，琥珀酸作為發(fā)酵碳源可以提高菌體量并同時(shí)提高PMP產(chǎn)量。綜合以上的工作，使用琥珀酸發(fā)酵的重組菌SHX5胞內(nèi)的P

9、MP含量可以穩(wěn)定在5％-6％。我們初步實(shí)現(xiàn)了利用DTDP合成PMP的目的。
　　 盡管如此，但該菌株的產(chǎn)量較低，并且使用的琥珀酸碳源價(jià)格昂貴。為了進(jìn)一步提高PMP產(chǎn)量和降低成本，從發(fā)酵水平分別對(duì)碳源進(jìn)行比較，并對(duì)發(fā)酵具體方式進(jìn)行優(yōu)化以及發(fā)酵中各組分隨時(shí)間的改變進(jìn)行分析。結(jié)果表明當(dāng)以甘油為碳源時(shí)，細(xì)胞雖然生長緩慢，但可以積累到和以琥珀酸為碳源時(shí)相似的菌體量，并且PMP的胞內(nèi)含量幾乎提高了一倍，達(dá)到了10％，這使它成為替代琥珀酸的廉

10、價(jià)碳源。一個(gè)出乎意料的結(jié)果表明在使用甘油和丙酸的混合碳源培養(yǎng)基中(丙酸濃度設(shè)為0.2％(w/v))，丙酸作為一種‘刺激物’進(jìn)一步提高了聚合物產(chǎn)量（聚合物占細(xì)胞總重量的18％左右），并提高了菌體的生長速率。但這種發(fā)酵方法使含有3MP單體的PTE中混入了少量的3HB和3HV單體（占PTE總質(zhì)量分?jǐn)?shù)少于10％），并得到了一種含有三種單體的未見報(bào)道的新化合物poly（3MP-co-3HB-co-3HV）。之后對(duì)該類聚合物組成在發(fā)酵時(shí)間上的變化進(jìn)

11、行了分析，最終發(fā)現(xiàn)很難通過控制發(fā)酵時(shí)間的方法將3HB和3HV單體去除。這說明這種混合碳源的發(fā)酵模式無法很好的用于PMP的生產(chǎn)。
　　 為了進(jìn)一步提高PMP的產(chǎn)量，我們對(duì)之前的結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)在使用甘油為碳源后，作為對(duì)照的不含有BPEC途徑的菌株SHX12也可以積累不顯著的PMP（胞內(nèi)含量低于2％），多次重復(fù)結(jié)果相同。這提示該菌株自身含有一條內(nèi)在的PMP途徑。通過與基因組的序列比對(duì)分析，找到了PhaEC的同工酶:由內(nèi)源的pha

12、CAm基因編碼的PHA合成酶(PhaCAm)。將phaCAm基因進(jìn)行敲除，比較其對(duì)內(nèi)源PMP合成途徑和重組的BPEC代謝途徑合成PMP的影響，結(jié)果說明了三點(diǎn):第一，起關(guān)鍵作用的酶是其自身的phaCAm基因編碼的PHA合成酶PhaCAm。第二，盡管phaE和phaC基因的轉(zhuǎn)錄本可以通過逆轉(zhuǎn)錄PCR被檢測(cè)到，但是異源表達(dá)的同工酶PhaEC在該菌株中沒有活性，也沒有對(duì)PMP合成有任何貢獻(xiàn)。第三，驗(yàn)證了之前的結(jié)論，即插入基因組的buk-ptb操

13、縱子所表達(dá)的Buk和Ptb對(duì)PMP合成有比較重要的影響，顯著提高了菌株合成PMP的能力。從而最終發(fā)現(xiàn)并鑒定了編碼內(nèi)源PMP合成途徑上的PHA合成酶基因phaCAm。為了尋找更優(yōu)的PHA合成酶，我們比較了三種不同來源的phaC基因。結(jié)果表明其自身來源的phaCAm是最有效的。
　　 進(jìn)一步對(duì)內(nèi)源phaC進(jìn)行了過量表達(dá)來提高PMP的含量，并優(yōu)化得到了最佳的PHA合成酶的表達(dá)量來滿足最大化的PMP合成。我們得到了PMP產(chǎn)量最高的菌株S

14、HX22。產(chǎn)量達(dá)到20％，最高可以得到25％。對(duì)菌株SHX22的菌體干重、PMP含量和培養(yǎng)基中各組分進(jìn)行了隨發(fā)酵時(shí)間的變化分析，最終發(fā)現(xiàn)3MP的“相對(duì)剩余”的現(xiàn)象。在A.mimigardefordensis菌株的細(xì)胞中，3MP分子只能快速的被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外而不能成功的穿越細(xì)胞膜再次進(jìn)入細(xì)胞。我們判斷這是導(dǎo)致PMP產(chǎn)量無法繼續(xù)提高的一個(gè)重要限制因素。據(jù)此提出了三種解決方案:第一種通過降低DTDP的濃度進(jìn)而降低胞內(nèi)DTDP的降解速度來協(xié)調(diào)其和P

15、MP合成速度的策略，但該方法最終被證明是不可行的。第二種方法尋找一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將3MP轉(zhuǎn)入胞內(nèi)比較困難，第三種策略是進(jìn)一步提高3MP到3MP-CoA的轉(zhuǎn)化速率。為此我們尋找到了合適的酶，即來自Clostridiumkluyveri的cat2，并在大腸桿菌中成功的驗(yàn)證了其功能。進(jìn)一步驗(yàn)證工作正在進(jìn)行。
　　 最后我們建立了一種適合于重組菌的PMP純化方法，獲得了純的PMP產(chǎn)物，并通過GC/MS的分析確認(rèn)了得到的PMP產(chǎn)物的均一性。尼

16、羅紅染色證實(shí)該菌株中的PMP是以常規(guī)的PMP顆粒的形式存在。而這種具有生物活性PMP顆?？梢允刮覀儗?duì)其和完整PHA酶系之間的關(guān)系進(jìn)行深入研究。為此我們優(yōu)化并建立了一套適合于該菌株的活性PMP顆粒的甘油密度梯度超速離心的純化方法并試著對(duì)其蛋白成分組成進(jìn)行了分析。
　　 PMP材料是用生物方法人工合成的新型聚合物材料。因?yàn)椴牧显谛再|(zhì)上的優(yōu)越性，具有較高的實(shí)用價(jià)值。但其生產(chǎn)目前受限于前體底物3MP的毒性，采用低毒性的DTDP進(jìn)行PMP

17、合成無疑具有很大的優(yōu)勢(shì)。本論文通過對(duì)一株可以利用DTDP進(jìn)行生長的菌株A.mimigardefordensis進(jìn)行異源PMP合成途徑BPEC的構(gòu)建和優(yōu)化，以及之后的一系列發(fā)酵優(yōu)化改造，成功實(shí)現(xiàn)了利用低毒性DTDP為底物，在不能生產(chǎn)PMP的菌株細(xì)胞中積累到10％的PMP含量。之后，通過內(nèi)源的新的PMP合成途徑的發(fā)現(xiàn)以及之后的關(guān)鍵酶phaCAm的鑒定和優(yōu)化，將PMP胞內(nèi)含量進(jìn)一步提高到了20％，最高可以達(dá)到25％.之后對(duì)合成的PMP進(jìn)行了純