咖啡因長(zhǎng)期暴露影響甜味偏好及腸道糖吸收的基礎(chǔ)研究.pdf

1、咖啡因具有幾千年的使用歷史,是世界范圍內(nèi)最普遍消費(fèi)的活性食物成分。關(guān)于咖啡因廣泛食用而產(chǎn)生的厭食作用,從而幫助人們維持或降低體重這一觀點(diǎn)一直存在爭(zhēng)議。而且目前對(duì)于咖啡因引起的厭食作用研究?jī)H僅是從動(dòng)物及人類對(duì)食物的認(rèn)知及動(dòng)機(jī)出發(fā),對(duì)于其具體的機(jī)制尚不清楚。味覺(jué)是動(dòng)物攝食行為的主要調(diào)節(jié)及驅(qū)動(dòng)因子,咖啡因暴露后引起的厭食作用是否來(lái)自于味覺(jué)基礎(chǔ)的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。所以本研究結(jié)合近年來(lái)味覺(jué)感受機(jī)制、味覺(jué)感受影響因素和味覺(jué)可塑性等研究成果,提出了咖啡

2、因長(zhǎng)期暴露改變攝食行為以味覺(jué)外周感受器味蕾的變化為基礎(chǔ)的假設(shè)。以ICR小鼠為動(dòng)物模型,采用動(dòng)物行為學(xué)、免疫組織化學(xué)、Western blot、實(shí)時(shí)熒光PCR及ELISA等多種方法相結(jié)合,探究了咖啡因長(zhǎng)期暴露不同年齡段小鼠味覺(jué)行為改變與外周感受器即味蕾特征性變化(包括味蕾及味蕾細(xì)胞形態(tài)變化、味覺(jué)感受相關(guān)蛋白表達(dá)量變化)之間的相關(guān)性;同時(shí)延伸了咖啡因長(zhǎng)期暴露作用,探討了咖啡因長(zhǎng)期暴露對(duì)小腸絨毛形態(tài)、甜味感受相關(guān)蛋白表達(dá)及腸道內(nèi)葡萄糖吸收的影

3、響;并且通過(guò)不同咖啡因刺激方式探討了食物口腔感受及食物攝入后作用在味覺(jué)感受變化中的貢獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果從多角度揭示了外周味覺(jué)感受器變化與咖啡因引起厭食作用的相關(guān)性,為咖啡因長(zhǎng)期作用引起的厭食作用提供了味覺(jué)感受基礎(chǔ)方面的理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 (1)咖啡因長(zhǎng)期暴露改變小鼠味覺(jué)偏好
　　 不同年齡段正常組小鼠對(duì)咖啡因表現(xiàn)出不同的偏好模式,P24小鼠表現(xiàn)為典型的“冷漠-回避”模式,回避閾值為5.17 mmol/L;

4、而P32及P49小鼠表現(xiàn)為典型的“冷漠-偏好-回避”,偏好閾值分別為0.92mmol/L和0.09 mmol/L,回避閾值分別為5.17 mmol/L和16.28mmol/L。與對(duì)照組小鼠性比,咖啡因暴露對(duì)不同年齡段小鼠咖啡因味覺(jué)偏好模式無(wú)影響,但增強(qiáng)各年齡段小鼠耐受性。青春前期及青春期小鼠表現(xiàn)為偏好率的增加,而青春期及成年小鼠還表現(xiàn)為偏好閾值的升高,偏好閾值分別為5.17 mmol/L和0.29 mmol/L。各個(gè)年齡段對(duì)照組及咖啡因

5、暴露組小鼠具有相同的AK糖偏模式及最佳偏好濃度,表現(xiàn)為典型的“冷漠-偏好-回避”模式。但咖啡因長(zhǎng)期暴露改變小鼠AK糖偏好閾值及偏好率,此作用具有刺激起始年齡差異性。與對(duì)照組小鼠相比,咖啡因暴露后降低青春前期小鼠AK偏好閾值,分別為1.33 mmol/L和0.42 mmol/L;而青春期及成年期刺激組小鼠表現(xiàn)為偏好閾值升高,均為0.42 mmol/L/1.33 mmol/L,偏好率降低,分別降低約6％和13.83％?？傊鲜鼋Y(jié)果表明不同年

6、齡段小鼠咖啡因味覺(jué)偏好模式不同,為其他以咖啡因?yàn)檠芯繉?duì)象的行為學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù);其次本研究證明了咖啡因長(zhǎng)期暴露后小鼠甜味偏好降低,為以小鼠為模型的咖啡因長(zhǎng)期暴露引起可口食物厭膩感作用研究提供了行為學(xué)依據(jù)。
　　 (2)咖啡因長(zhǎng)期暴露改變小鼠菌狀味蕾解剖形態(tài)特征
　　 咖啡因長(zhǎng)期暴露對(duì)舌面味蕾總數(shù)的影響無(wú)咖啡因暴露劑量差異性,除青春期500 mg/L對(duì)照組小鼠外,長(zhǎng)期咖啡因暴露不改變小鼠舌面菌狀味蕾總數(shù),單個(gè)舌面味蕾數(shù)

7、量基本位于100-110個(gè)之間。咖啡因長(zhǎng)期暴露后各年齡段小鼠菌狀味蕾最大橫截面積雖無(wú)顯著變化,橫截面積基本位于1500-1600μm2之間,但與對(duì)照組小鼠相比,青春期及成年咖啡因刺激組小鼠菌狀味蕾最大橫截面呈明顯減少趨勢(shì);同時(shí)味蕾縱軸高度也因咖啡因暴露而顯著降低,與對(duì)照組小鼠相比,青春前期、青春期及成年激組小鼠味蕾高度分別降低13％/11％、13％/13％、13％/13％(300 mg/L/500 mg/L刺激組);而且咖啡因長(zhǎng)期暴露后

8、單個(gè)味蕾中細(xì)胞總數(shù)也呈減少趨勢(shì),尤其是青春期及成年小鼠味蕾細(xì)胞總數(shù)顯著減少,與對(duì)照組相比分別減少20％/14％、15％/8％(300mg/L/500 mg/L刺激組),而且具有顯著的咖啡因暴露劑量差異性。綜上所述咖啡因長(zhǎng)期暴露通過(guò)減少味蕾最大橫截面積、味蕾縱軸高度及單個(gè)味蕾中味細(xì)胞總數(shù),綜合減小味蕾體積,而且這種作用具有刺激起始年齡差異性,與青春前期小鼠相比,青春期及成年小鼠受咖啡因影響更大。而味蕾體積及味蕾細(xì)胞數(shù)量的減少可能導(dǎo)致味覺(jué)傳

9、入信息及味覺(jué)感受神經(jīng)激活的降低,從而影響動(dòng)物的飲食行為。
　　 (3)咖啡因長(zhǎng)期暴露改變菌狀味蕾甜味感受相關(guān)蛋白表達(dá)
　　 免疫熒光定量結(jié)果表明,長(zhǎng)期咖啡因暴露顯著降低所有年齡段小鼠單個(gè)菌狀味蕾中α-gustducin陽(yáng)性味細(xì)胞數(shù),與對(duì)照組小鼠相比,500 mg/L咖啡因長(zhǎng)期暴露后P24、P32及P49天雄性小鼠單個(gè)味蕾中a-gustducin陽(yáng)性味蕾細(xì)胞數(shù)分別分別減少約22％、15％和23％,平均減少20％;與雌性小鼠

10、相比,雄性小鼠受咖啡因影響程度更大(P＜0.05),雌性P24/P32/P49天刺激組小鼠單個(gè)味蕾陽(yáng)性味蕾細(xì)胞數(shù)分別減少15％、9％和16％,平均減少約13％,所以后期實(shí)驗(yàn)均采用雄性ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。與對(duì)照組小鼠相比,300 mg/L雄性P24/P32/P49天刺激組小鼠單個(gè)味蕾中α-gustducin陽(yáng)性味細(xì)胞數(shù)分別減少約29％、33％和37％,平均減少33％,下降率顯著高于500 mg/L刺激組小鼠(P＜0.05),所以后期實(shí)驗(yàn)

11、中均采用300 mg/L咖啡因暴露濃度。而且上述300 mg/L咖啡因長(zhǎng)期暴露對(duì)α-gustducin表達(dá)影響通過(guò)WesternBlot結(jié)果得到進(jìn)一步證實(shí),與對(duì)照組小鼠相比,P24,P32,P49三個(gè)年齡咖啡因刺激小鼠α-gustducin蛋白表達(dá)豐度分別降低約1.43、1.29和1.28倍。同時(shí)利用Western Blot技術(shù)對(duì)PLCβ2、甜味受體T1R2/T1R3及SNAP25的表達(dá)豐度分析表明,與對(duì)照組小鼠相比,P24/P32/P

12、49天咖啡因刺激組小鼠PLCβ2也呈下調(diào)趨勢(shì),分別下調(diào)約1.35、1.41和1.08倍;但甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達(dá)豐度呈上調(diào)趨勢(shì),分別上調(diào)3.28/2.18、3.29/1.94和2.55/2.05倍;而對(duì)SNAP25表達(dá)基本無(wú)影響。而且通過(guò)比較四種不同刺激物(咖啡因、奎寧、AK及蔗糖)長(zhǎng)期暴露對(duì)小鼠味覺(jué)感受蛋白表達(dá)影響結(jié)果發(fā)現(xiàn),咖啡因?qū)Ω鞣N味覺(jué)感受蛋白表達(dá)的影響具有特異性。總之咖啡因長(zhǎng)期暴露影響味覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白α-gustdu

13、cin(減少)、PLCβ2(減少)、甜味受體蛋白T1R2/T1R3(增加)表達(dá)。而且這些影響具有性別及暴露劑量差異性,雄性受影響程度更大,低劑量咖啡因暴露作用更大。
　　 綜合以上三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明咖啡因長(zhǎng)期暴露改變不同年齡段小鼠外周味覺(jué)感受器-味蕾解剖形態(tài)(包括減少味蕾最大橫截面及縱軸高度,單個(gè)味蕾中味細(xì)胞總數(shù)),同時(shí)伴隨有味覺(jué)感受相關(guān)蛋白α-gustducin、PLCβ2表達(dá)豐度降低,甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達(dá)豐度增

14、加,而這些結(jié)構(gòu)與功能的變化可能是咖啡因長(zhǎng)期暴露降低甜味偏好的味覺(jué)基礎(chǔ)。
　　 (4)咖啡因長(zhǎng)期暴露改變小腸不同區(qū)域甜味感受相關(guān)蛋白表達(dá)及腸道內(nèi)葡萄糖耐受性
　　 長(zhǎng)期咖啡因暴露顯著增加小鼠小腸各部分絨毛高度,與對(duì)照組小鼠相比,刺激組小鼠十二指腸、中間段空腸及回腸小腸絨毛高度分別增長(zhǎng)約8％、6％及3％;而對(duì)隱窩深度的影響恰好相反,刺激組小鼠十二指腸、中間段空腸及回腸隱窩的深度分別減少約7％、3％及7％。綜合以上結(jié)果,咖啡因

15、暴露組小鼠各段小腸絨毛絨腺比顯著增加,分別增加約9％、9％和10％。免疫共定位結(jié)果表明α-gustducin與甜味受體蛋白T1R2/T1R3存在小腸各個(gè)部分,而且彼此存在共表達(dá)。而Western Blot對(duì)上述蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析表明,與對(duì)照組小鼠相比,十二指腸、空腸及回腸中甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達(dá)豐度均顯著呈增加趨勢(shì),分別上調(diào)2.38/1.74倍、1.61/2.17倍和1.71/2.30倍;而α-gustducin表達(dá)豐度在

16、十二指腸中呈下降趨勢(shì),空腸及回腸中無(wú)顯著變化;咖啡因長(zhǎng)期暴露基本不改變下SNAP25在各段小腸中表達(dá)。根據(jù)甜味受體及α-gustducin在腸道甜味感受、餐后GLP-1等其他腸道激素分泌調(diào)節(jié)的中作用及我們的研究結(jié)果,對(duì)禁食葡萄糖灌胃后血漿中GLP-1及胰島素釋放及葡萄糖耐受性進(jìn)行分析,結(jié)果表明與對(duì)照組小鼠相比,咖啡因刺激小鼠對(duì)葡萄糖存在更高的GLP-1及胰島素分泌,同時(shí)受到咖啡因長(zhǎng)期暴露的影響,刺激組小鼠葡萄糖耐受性顯著增強(qiáng)。綜上所述咖

17、啡因長(zhǎng)期暴露顯著增加小腸絨毛高度,上調(diào)小鼠各部分小腸甜味受體蛋白TlR2/T1R3表達(dá)豐度,改變腸道內(nèi)甜味感受生物學(xué)基礎(chǔ);另外咖啡因長(zhǎng)期暴露增強(qiáng)GLP-1及胰島素對(duì)腸道內(nèi)葡萄糖存在的響應(yīng),同時(shí)也改變了腸道內(nèi)葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡;但是關(guān)于這些改變的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的深入探究。
　　 (5)咖啡因口后攝入作用對(duì)口腔味覺(jué)感受器特征改變的貢獻(xiàn)
　　 利用口后灌胃與口腔自由飲用咖啡因溶液方式分析咖啡因攝入后作用對(duì)味覺(jué)外周感受器味