氨基酸代謝輪廓耦合RT-PCR分析誘變菌株高效發(fā)酵雷帕霉素.pdf

1、雷帕霉素（Rapamycin）是一種天然的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有各種各樣的生物活性，例如抗真菌、免疫抑制劑、抗腫瘤、神經(jīng)保護和抗衰老等。在臨床上被用于器官移植的抗排斥反應和自身免疫性疾病的治療，相比環(huán)孢菌素而言，雷帕霉素表現(xiàn)出更強的臨床藥用價值和更低的毒副作用，因此雷帕霉素的研究備受學術界和各大制藥企業(yè)的青睞與關注。
　　1.根據(jù)以前文獻報道，莽草酸的添加能夠提高雷帕霉素的產(chǎn)量，本文從吸水鏈霉菌誘變菌株U2-3D9出發(fā)，進行新一輪

2、紫外誘變篩選獲得一株雷帕霉素莽草酸耐受菌株U3-SD，其產(chǎn)量達到389.7mg/L，相比誘變菌株U2-3D9(273mg/L)，雷帕霉素產(chǎn)量提高了42.7％。
　　2.雖然通過紫外誘變獲得了一株雷帕霉素高產(chǎn)菌株，但是雷帕霉素高產(chǎn)機制仍然不清楚，而且通過比較吸水鏈霉菌誘變菌U3-SD與原始菌ATCC29253胞外發(fā)酵特性，結果仍然無法揭示雷帕霉素的高產(chǎn)機制。為了剖析雷帕霉素生產(chǎn)機理并用于強化其合成，利用氨基酸代謝輪廓分析比較原始菌與

3、誘變菌株U3-SD之間胞內(nèi)氨基酸庫變化來揭示限制雷帕霉素的合成因素。首先在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢測下86種代謝物被鑒定，然后采用主成分分析、層聚類分析和偏最小二乘法分析發(fā)現(xiàn)原始菌和誘變菌之間存在代謝差異，同時發(fā)現(xiàn)與雷帕霉素合成相關的潛在生物標志物有22種，最后在此基礎上通過代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝在雷帕霉素合成中具有重要的作用，包括賴氨酸、纈氨酸、色氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和鳥氨酸。
　　3.在氨基酸代謝輪廓分析指導下，

4、采用HPLC檢測細胞內(nèi)上述7種氨基酸胞內(nèi)絕對含量，發(fā)現(xiàn)誘變菌細胞內(nèi)氨基酸代謝供應不足，即“氮饑餓現(xiàn)象”，且與原始菌之間濃度差異最顯著的是賴氨酸。為了驗證賴氨酸代謝是雷帕霉素合成的關鍵代謝模塊，采用實時熒光定量PCR和酶活檢測分析賴氨酸代謝途徑上的關鍵酶（二氫吡啶二羧酸合酶、丙酮酸羧化酶和賴氨酸環(huán)化脫氨酶），結果發(fā)現(xiàn)誘變菌賴氨酸代謝途徑上關鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄水平和酶活均提高了，表明這三個酶與雷帕霉素合成具有正相關性，在理性指導下通過添加不同濃