脂肪酸用于螺旋藻、節(jié)旋藻分類的可行性研究.pdf

1、螺旋藻、節(jié)旋藻系藍(lán)藻門（Cyanophyta），段殖藻目（Hormogonales），顫藻科（Oscilatoraceae），是光合自養(yǎng)型原核微生物。人們借助于16S rRNA、16S-23S rRNA（ITS區(qū)）、cpcB、cpcA、hoxY、psbA、cpcE-F等基因序列分析，發(fā)現(xiàn)螺旋藻、節(jié)旋藻在屬水平上具有明顯差別，認(rèn)為螺旋藻、節(jié)旋藻應(yīng)為獨(dú)立的兩個(gè)屬。但關(guān)于種定義的問題仍在爭(zhēng)論。本實(shí)驗(yàn)室在獲得大量新藻株的基礎(chǔ)上，欲采用多相分類方

2、法，構(gòu)建相對(duì)完善的螺旋藻、節(jié)旋藻種屬分類系統(tǒng)。課題組成員首先基于16S rRNA基因、ITS區(qū)、rpoC1基因、cpcB基因、psbA基因、hoxY基因序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，均支持螺旋藻、節(jié)旋藻獨(dú)立為兩個(gè)不同屬的觀點(diǎn)。但是，個(gè)別藻株的歸屬不穩(wěn)定，且屬內(nèi)藻株的基因序列相似性較高，無法確定不同種。因此為了驗(yàn)證基于基因序列分類的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步尋找種水平分類的靶標(biāo)分子，本課題以渤海海濱濕的螺旋藻、節(jié)旋藻藻株為研究對(duì)象，檢測(cè)其脂肪酸組成及含量，

3、通過聚類分析尋找特征脂肪酸，并以脂肪酸為標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，豐富螺旋藻、節(jié)旋藻的分類依據(jù)和方法，以期獲得更能反映藻株親緣關(guān)系的分類結(jié)果。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴藻株的分離純化：從在渤海海濱濕地及其周邊水域采集的水樣中，分離純化獲得34株單藻絲純種，擴(kuò)大了本研究的樣本量，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)特征進(jìn)行了研究；⑵脂肪酸檢測(cè)方法的建立：首先對(duì)比了VF-23MS與HP-88兩種色譜柱對(duì)37種脂肪酸甲酯的分離效果，選取了能將37種脂肪酸甲酯有

4、效分離的HP-88色譜柱，并確立了最優(yōu)色譜條件，即進(jìn)樣口：加熱器250℃，分流比8:1；控制模式為流速控制，流速為0.5mL/min，柱前壓19.783psi；升溫程序：初始溫度100℃，保持4min，以8℃/min上升至175℃，保持7min，然后以1℃/min上升至186℃，保持3min，最后以5℃/min升至230℃，保持30min；檢測(cè)器溫度（FID）260℃。其次，在脂質(zhì)萃取過程中，考察了不同溶劑的萃取效果，依據(jù)脂質(zhì)提取率和色

5、譜圖質(zhì)量，最終確定正己烷為提取藻株脂肪酸的萃取溶劑。再次，Central Composite響應(yīng)面優(yōu)化螺旋藻脂肪酸提取條件，建立回歸模型，獲得優(yōu)化方案，即超聲時(shí)間21min，水浴時(shí)間93min，催化劑濃度1.8％，甲酯化溫度70℃，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，得到平均峰面積為31008.1667，與理論值相比，其平均偏差為5.59%。最后，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下回收率為94.56%~103.23%，表明該

6、方法回收率比較穩(wěn)定，為后續(xù)的脂肪酸檢測(cè)提供了依據(jù)；⑶螺旋藻、節(jié)旋藻藻株分類：應(yīng)用本研究建立的檢測(cè)方法對(duì)84株供試藻株進(jìn)行脂肪酸提取、氣相色譜分析，最后通過聚類分析，尋找可用于螺旋藻（節(jié)旋藻）屬種類的脂肪酸生物標(biāo)記。研究表明：F-351、F-1070兩藻株不含C18:3n6，結(jié)合基于16S rRNA基因、ITS區(qū)等分子方法的聚類結(jié)果，進(jìn)一步支持節(jié)旋藻、螺旋藻兩屬之間的差異性脂肪酸成分為γ-亞麻酸的觀點(diǎn)；節(jié)旋藻屬脂肪酸組分除含有γ-亞麻酸（

7、C18:3n6）這一特征組分外，均有高含量的C16:0；另外，大部分藻株也含有C16:1、C18:0、C18:1n9c、C18:2n6c；以10個(gè)脂肪酸統(tǒng)計(jì)參數(shù)為指標(biāo)對(duì)節(jié)旋藻屬藻株進(jìn)行聚類分析，將81個(gè)供試藻株劃分為5個(gè)脂肪群；并通過聚類分群分析發(fā)現(xiàn)，以脂肪酸為標(biāo)記的分類結(jié)果與基于 psbA基因序列的聚類結(jié)果存在一定的一致性；依據(jù)脂肪酸分析，修正藻株TJBC3的分類地位，該藻株應(yīng)歸為螺旋藻屬；針對(duì)基于psbA基因序列及聯(lián)合基因分析提出的