Stenotrophomonas maltophilias DHHJ角蛋白酶類型及Nano-Lc MS-MS解析.pdf

1、近年來，角蛋白廢棄物因其具有很高的蛋白含量而越來越得到人們的關(guān)注。對角蛋白廢棄物進行大量的，有效的降解成為了研究的熱點。其中，利用微生物降解角蛋白廢棄物更是因為其降解條件溫和，能耗低，可以大量應(yīng)用，產(chǎn)物利于純化以及對環(huán)境無污染等特點而受到了廣泛的關(guān)注。但是對于微生物降解角蛋白的機制目前還是世界性的難題。本論文以本課題前期試驗分離得到的降解角蛋白的菌株嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ為研究對象，研究其降解角蛋白的降解機制，包括不同發(fā)酵培養(yǎng)基條件下

2、的酶活的變化情況以及菌體表面的形態(tài)變化情況;以及利用不同的純化手段對所得的粗酶液進行純化，進而對純化的酶液進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析得到其肽段序列，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　將該菌分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和羽毛培養(yǎng)基中利用發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，同時測得其胞內(nèi)酶和胞外酶的酶活。證明該菌所分泌的角蛋白酶為一種誘導(dǎo)酶。但是其也有一定的組成性表達并少量分泌到培養(yǎng)基中，這同時也證明了羽毛并不是該菌所分泌的角蛋白酶的唯一底物。
　　同時利用掃描電

3、鏡觀察該菌在上述兩種培養(yǎng)基中的表面形態(tài)的變化情況，發(fā)現(xiàn)該菌在兩種培養(yǎng)基上都能觀察到細菌表面產(chǎn)生一定的凹陷。但是，通過對比兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)中該菌表面形態(tài)的變化，羽毛培養(yǎng)基條件下該菌所產(chǎn)生的凹陷程度更明顯，數(shù)量也更多。根據(jù)這些可以推測出該菌對于角蛋白的降解機制，一方面有該菌分泌角蛋白酶到外界環(huán)境中降解角蛋白，另一方面，該菌能夠改變其細胞膜的表面形態(tài)來吸收外界降解的角蛋白小分子至細胞內(nèi)進行進一步的降解，同時，胞內(nèi)酶起到了促進胞外酶分泌的作用。<

4、br>　　對嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ進行發(fā)酵后對其發(fā)酵液中的胞外酶進行初步的純化研究。首先經(jīng)過鹽析，溶液中硫酸銨飽和度在0％-20％之間對角蛋白酶有較好的分離度。之后分別以CHT羥基磷灰石和DEAE離子交換為分離介質(zhì)對經(jīng)過鹽析的角蛋白酶進行進一步純化，發(fā)現(xiàn)DEAE離子交換介質(zhì)對于角蛋白酶的初步分離具有更好的效果，之后將經(jīng)過DEAE離子交換純化過的角蛋白酶溶液通過G-50葡聚糖凝膠，表明G-50葡聚糖凝膠不能再次分離角蛋白酶和其他的雜蛋白

5、，所以本研究將純化條件限定為鹽析純化和DEAE離子交換純化。
　　將經(jīng)過DEAE柱層析純化過的角蛋白酶進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析，分析報告表明，該角蛋白酶中可能含有一個大多數(shù)水解酶都具有的功能結(jié)構(gòu)域—α/β折疊水解結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可能在角蛋白酶降解角蛋白過程中起到關(guān)鍵的作用。α/β折疊水解結(jié)構(gòu)域分子量大約為31kDa，其與SDS-PAGE中所得的蛋白條帶存在一定的差異，這可能是因為角蛋白酶在純化過程中會產(chǎn)生一定的降解，SDS-PAGE中2