四種重要海洋雙殼類(bivalve)群體遺傳結(jié)構(gòu)與多樣性研究.pdf

1、我國是世界上貝類人工育苗規(guī)模最大、增養(yǎng)殖產(chǎn)量最多的國家，這些貝類中大部分是海洋雙殼類，保護(hù)這些原始優(yōu)良種質(zhì)，并利用這些優(yōu)良的種質(zhì)資源培育新品種、新品系，對(duì)海洋產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有戰(zhàn)略意義。種質(zhì)遺傳資源的有效保護(hù)和合理利用依賴于對(duì)其遺傳特性的研究，開展海洋雙殼類群體遺傳學(xué)研究不僅具有重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文利用rDNA的ITS2序列、SSR技術(shù)和mtDNA的16S rRNA與COI基因片段序列等幾種分子遺傳學(xué)標(biāo)記，探索研

2、究西施舌(Coelomactra antiquata)、文蛤(Meretix meretrix)、四角蛤蜊(Mactraquadrangularis)及毛蚶(Scapharca subcrenata)等四種重要海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)雙殼類(Bivalve)的群體遺傳特性，為這些海洋貝類資源的科學(xué)保護(hù)和合理利用提供科學(xué)依據(jù)。本研究取得的主要結(jié)果如下：
　　 一、西施舌的種群遺傳多樣性研究
　　 測定了5個(gè)不同群體133個(gè)樣本的西施舌rD

3、NA的ITS2(second internaltranscribed spacer region)序列，分析了該物種的群體遺傳結(jié)構(gòu)，同時(shí)利用線粒體16S rRNA基因序列片段進(jìn)一步比較比較了群體間的遺傳變異狀況。
　　 1、ITS2序列的群體間及群體內(nèi)遺傳變異的比較結(jié)果顯示：1)ITS2序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為523～537 bp，ITS2非編碼區(qū)序列全長為389～401bp，平均GC含量為59.7％，多態(tài)性變異位點(diǎn)28個(gè)，其

4、中簡約信息位點(diǎn)18個(gè)，另外有15個(gè)位點(diǎn)的插入/丟失；序列的核苷酸多態(tài)性Pi為1.99％。2)5個(gè)群體共得到38個(gè)單元型，單元型的多態(tài)性(Hd)為89.3％，共享單元型7個(gè)，各群體均有其特有單元型(GenBank登錄號(hào)：FJ827075-FJ827079)，其中，長樂群體特有單元型最多，共22個(gè)；以Kumura-2-P法構(gòu)建了群體間的NJ樹、UPGMA樹及ME樹，以及用Network軟件構(gòu)建了單元型間的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，系統(tǒng)聚類分析得出：長

5、樂群體與北方4個(gè)群體(QD、GY、RZ及JM)之間已存在明顯遺傳分化(遺傳距離d=0.029-0.032，遺傳分化指數(shù)FST=0.6617-0.6398)，北方4個(gè)群體間沒有明顯遺傳差異(FST＜0)。
　　 2、PCR擴(kuò)增16S rRNA基因片段的序列長度為450bp，分析群體間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，得到與ITS2系統(tǒng)樹相一致的結(jié)果：1)不包括長樂群體在內(nèi)的其它群體間的遺傳距離為0.0～0.007；2)長樂群體與其它幾個(gè)群體間有明顯

6、遺傳分化，以線粒體的分子鐘進(jìn)化速率每百萬年2％為標(biāo)準(zhǔn)(Brown et al.，1979)，群體的分化時(shí)間在3.33Myr以前；3)群體間的遺傳距離d=0.077-0.081，序列的核苷酸差異度為6.67％。
　　 依據(jù)這兩種序列的分析結(jié)果，從資源的保護(hù)與利用上長樂群體與北方群體應(yīng)分別作為不同的管理單元；依據(jù)與其它相關(guān)研究分析比較，推測長樂群體可能為一個(gè)地理亞種；研究表明ITS2序列作為西施舌群體遺傳結(jié)構(gòu)的分子標(biāo)記是可行的。

7、r>　　 二、毛蚶、文蛤及四角蛤蜊的微衛(wèi)星(Simple Sequence Repeats，SSR)標(biāo)記篩選及群體遺傳多樣性分析
　　 1、毛蚶的SSR篩選與群體遺傳多樣性研究結(jié)果：1)共得到陽性克隆29個(gè)，其中有24個(gè)重復(fù)次數(shù)在5次以上的微衛(wèi)星序列，除探針中使用的CA及GA重復(fù)外，還得到CG重復(fù)序列，其中(CA)n類型最多，四核苷酸重復(fù)有：TATC和TTTC；2)獲12對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物標(biāo)記，GenBank登錄號(hào)為：EU48

8、3140-EU483151；3)PCR擴(kuò)增毛蚶江蘇群體，分析得到12個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)普遍很高，只有N263位點(diǎn)的PIC值較低(PIC=0.342)，其它位點(diǎn)的PIC值均大于0.5(0.619～0.926)，位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為12.4，群體的觀察雜合度(H0)的范圍：0.182～0.917，期望雜合度(HE)為0.422～0.947。4)用GENEPOP軟件分析表明各位點(diǎn)沒有存在連鎖不平衡(LD)，有5個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪一溫

9、伯格平衡(HWE)，經(jīng)檢驗(yàn)這些偏分離均是由于無效等位基因引起的雜合子缺失所致。5)用這些多態(tài)性引物跨種擴(kuò)增了文蛤、四角蛤蜊及西施舌等3種海洋經(jīng)濟(jì)貝類，其中有7對(duì)引物得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　 2、文蛤SSR的研究結(jié)果：1)共得到49個(gè)重復(fù)次數(shù)在5次以上的微衛(wèi)星序列，兩核苷酸重復(fù)的類型有：CA、GA及CG等3種重復(fù)序列類型，四核苷酸重復(fù)類型有14種，其中(TACA)n的重復(fù)次數(shù)達(dá)100；2)挑選、設(shè)計(jì)16對(duì)引物，PCR擴(kuò)增共得到12對(duì)有

10、多態(tài)性，GenBank登錄號(hào)為FJ232978～FJ232989；3)擴(kuò)增文蛤江蘇自然群體，結(jié)果表明各位點(diǎn)的PIC值普遍很高，只有WG347位點(diǎn)的PIC低于0.5(PIC=0.42)，位點(diǎn)的等位基因數(shù)在4～16之間，群體的H0為0.154～0.773，HHE為0.486～0.843；4)軟件分析表明這些位點(diǎn)間沒存在LD，有5個(gè)偏離HWE，P值經(jīng)過順序Bonferroni校正有2個(gè)位點(diǎn)偏離HWE，這些偏分離均為無效等基因?qū)е碌碾s合子缺失所

11、造成。
　　 3、四角蛤蜊SSR的研究結(jié)果：1)共得到36個(gè)重復(fù)次數(shù)大于5或重復(fù)序列長度12bp以上的微衛(wèi)星序列，其中，雙核苷酸重復(fù)有CA及GA兩種類型24個(gè)序列，其它類型有：5個(gè)四核苷酸重復(fù)，10個(gè)五核苷酸重復(fù)，還有六核苷酸重復(fù)、八核苷酸重復(fù)、十核苷酸重復(fù)及十三核苷酸重復(fù)各有1個(gè)；2)設(shè)計(jì)引物12對(duì)，其中8對(duì)具多態(tài)性，GenBank登錄號(hào)為EU924148～EU924155；3)擴(kuò)增江蘇群體28個(gè)樣本，結(jié)果表明各位點(diǎn)的PIC值

12、均高于0.5，各位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為9.75，群體HO的范圍為：0.040～1.0，HE為：0.040～0.940；4)用GENEPOP 3.4軟件分析表明6對(duì)符合HWE，各位點(diǎn)沒有存在LD，有兩個(gè)位點(diǎn)偏分離也為無效等位基因所致的雜合度不足造成。
　　 三、基于mtDNA COI基因序列片段的四角蛤蜊群體遺傳多樣性研究
　　 共擴(kuò)增26個(gè)個(gè)體的線粒體基因COI序列，通過分析研究了四角蛤蜊自然群體的遺傳多性，結(jié)果如下：1

13、)共獲得長度為626bp的COI序列片段26個(gè)，獲22個(gè)單元型，單元型多態(tài)性為0.978；2)序列有36個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，平均核苷酸差異為4.846；3)該COI基因片段序列的堿基組成分別為：0.218(A)，0.441 (T/U)，0.146(C)，和0.195(G)。
　　 全文研究結(jié)論：1)西施舌不同地理分布的群體均具有較高的遺傳多樣性水平，其中江蘇至山東的4個(gè)自然群體間沒有遺傳分化，長樂群體與上述4群體間遺傳分化明顯，遺傳差異