廣州管圓線蟲三種半胱氨酸蛋白酶在其各期蟲體中的免疫熒光定位.pdf

1、廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)依靠軟體動物作為其中間宿主，并以嚙齒類動物等作為其終宿主完成其整個生活史。人類是廣州管圓線蟲的偶然宿主，因誤食其感染性L3而引起廣州管圓線蟲病，其可入侵人體并停留在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嗜酸性粒細胞增多性腦膜腦炎。近年來，廣州管圓線蟲病作為一種新發(fā)的傳染病正受到越來越多的重視。但是我們對此寄生蟲的了解仍然比較欠缺，對一些與其寄生生活相關(guān)的基因更是知之甚少，對這些基因的研究包

2、括了基因全長的克隆，序列的比對，各期蟲體基因表達量的測定，目的蛋白的免疫組化等。這些都有助于我們進一步研究該基因并將之應(yīng)用于廣州管圓線蟲病的防治中。
　　 寄生蟲半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲的寄生生活中起著關(guān)鍵的作用，包括寄生蟲的營養(yǎng)攝取，組織入侵，免疫逃避，生長發(fā)育等等，不同的半胱氨酸蛋白酶存在于寄生蟲的不同組織，營著不同的功能，因此我們可以通過這些不同的半胱氨酸蛋白酶的定位來推測其在寄生蟲中的功能，為我們進一步的寄生蟲防治工作打好

3、理論基礎(chǔ)。
　　 本研究通過在NCBI上下載廣州管圓線蟲的三種半胱氨酸蛋白酶全長序列，分別是Ac-CathB-1，Ac-CathB-2和Ac-Hem，用primer5分別設(shè)計特異性引物并將這三種半胱氨酸蛋白酶表達序列以蟲體mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行體外擴增，并將得到序列分別構(gòu)建表達載體，之后分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21表達菌中大量誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得重組蛋白并純化，然后將這些純化后重組蛋白免疫小鼠，制備多克隆抗體。之后我們將這

4、些得到的抗體作為一抗，Cy3標記的羊抗小鼠IgG作為二抗對這三個半胱氨酸蛋白酶在各期幼蟲和成蟲中進行免疫熒光定位。
　　 結(jié)果顯示，Ac-CathB-1從一期幼蟲(L1)到成蟲中，都集中而且大量的分布于其消化系統(tǒng)中，在三期幼蟲(L3)中還分布于側(cè)翼上，成蟲腸道肌肉層有著少量而彌散的分布，腸道上皮微絨毛層則大量集中的分布，而且腸道內(nèi)容物也可見其分布，推測Ac-CathB-1在廣州管圓線蟲中起降解宿主血紅細胞，參與食物泡形成等營養(yǎng)攝

5、取的功能。Ac-CathB-2在幼蟲的神經(jīng)環(huán)中沒有分布，Ac-CathB-2在L1到四期幼蟲(L4)中不僅存在于消化系統(tǒng)上，而且存在于側(cè)翼上，在成蟲中大量分布于消化系統(tǒng)，原體腔，成蟲性腺尤其是輸精管壁和卵巢壁、子宮壁上，這些組織都涉及向外排出蟲體自身物質(zhì)的過程如外分泌蛋白，精子和卵子等，但在L4和五期幼蟲(L5)性腺形成期中，其并沒有分布于性腺上，因此推測其是作為一個協(xié)同參與外分泌作用的酶類，它有可能保證寄生蟲分泌，產(chǎn)卵，射精等過程順利