生物催化異黃腐酚合成8-異戊烯基柚皮素研究.pdf

1、8-異戊烯基柚皮素是啤酒花中發(fā)現(xiàn)的一種具有雌激素作用的異戊二烯基黃酮，被認為是迄今發(fā)現(xiàn)最具潛力的植物雌激素。除雌激素作用外，它還具備其他一些生理活性，包括預防癌癥，調節(jié)骨代謝，抑制血管增生和抗氧化等。本論文以異黃腐酚為前體，對8-異戊烯基柚皮素的生物催化合成進行了深入研究。
　　 首先建立了生物轉化體系中異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的同步檢測方法。檢測條件為Phenomenex C18反相柱(4.6 mm×250 mm，4μm)

2、，流動相：乙腈(A)-1％甲酸溶液(B)，檢測溫度30℃，流速0.8 mL/min，進樣量10μL，檢測波長288 nm，跑樣時間35 min，流動相比例為0-20 min，A40％-100％；20-25 min，A保持100％；25-28 min，A100％-40％。
　　 為了有效解決底物異黃腐酚價格昂貴的問題，本文利用高速逆流色譜技術和化學異構法構建獲得了1條高純度異黃腐酚的制備路線，所得的異黃腐酚結構經(jīng)高效液相色譜(HP

3、LC)、質譜(MS)和核磁共振(NMR)鑒定，純度大于90％，可用于后續(xù)的生物轉化研究。
　　 通過菌種篩選得到爪哇正青霉AS3.5706(Eupenicillium javanicum)作為生物催化合成8-異戊烯基柚皮素的菌株，同時確定種子預培養(yǎng)3 d后的直接生長轉化法G2作為最佳生物轉化方式，并設計響應面對轉化條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的條件為底物添加量0.1 mg/30mL，吐溫80添加量0.2％，接種量1％，葡萄糖濃度1％。

4、在此條件下，8-異戊烯基柚皮素得率可達6.62％，與未優(yōu)化前相比提高了48.6％。
　　 對調控生物轉化的關鍵酶進行了初步研究，建立了生物轉化體系中O-脫甲基酶酶活測定方法，對生物催化合成8-異戊烯基柚皮素的過程進行了分析，利用細胞色素P450酶抑制劑間接證明參與生物轉化反應的O-脫甲基酶是細胞色素P450酶系的一種。同時對生物轉化體系中的O-脫甲基酶的酶學性質進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)O-脫甲基酶的最適反應溫度為60℃，在30-60