抗核抗體及抗雙鏈DNA抗體熒光免疫層析法快速篩查試劑盒的研究.pdf

1、目的:本課題在當(dāng)今檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展提出的POCT(PointOf Care Testing)，即即時(shí)檢驗(yàn)新領(lǐng)域背景下，致力于開(kāi)發(fā)一種新的檢測(cè)試劑即熒光免疫層析快速檢測(cè)試劑盒，使用小型熒光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)，花費(fèi)時(shí)間在15分鐘左右，因此簡(jiǎn)單、便捷，標(biāo)本即到即檢，既能解決病人等待時(shí)間長(zhǎng)之問(wèn)題，又能解決臨床醫(yī)生執(zhí)行自身免疫性疾病臨床診斷的路徑問(wèn)題，可以在各級(jí)醫(yī)院臨床推廣使用，以提高自身免疫疾病的診治水平。
　　熒光免疫層析檢測(cè)法是一種將免疫

2、側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)、鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)和熒光檢測(cè)技術(shù)三者結(jié)合起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)首次將熒光蛋白作為其標(biāo)記物并結(jié)合了鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)，不僅提高了快速檢測(cè)的穩(wěn)定性也提高了試劑檢測(cè)的靈敏性。同時(shí)檢測(cè)速度快，整個(gè)分析過(guò)程只需要十五分鐘左右。這種技術(shù)是課題組的多項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)融合，將它用于抗核抗體的快速篩查檢測(cè)試劑盒的研發(fā)，可以填補(bǔ)抗核抗體的快速篩查領(lǐng)域中的空白。
　　綜上所述，本課題擬采用熒光免疫層析法用熒光免疫分析儀來(lái)檢測(cè)

3、血清標(biāo)本中ANA及dsDNA，開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)試劑盒，可用于AID的早期篩查和病情監(jiān)控。
　　方法:1、抗原的制備、純化、鑒定及固化
　　1.1、抗原制備、純化、鑒定:
　　根據(jù)自身免疫性抗原自身特點(diǎn)采取有效的方法（如基因工程合成、質(zhì)粒提取DNA等）制備抗原，純化后利用商品化的單克隆抗體檢測(cè)試劑盒和確診為相關(guān)自身免疫疾病且ANA或dsDNA陽(yáng)性的血清進(jìn)行驗(yàn)證，以驗(yàn)證制備的抗原是否合格，然后進(jìn)一步純化濃縮，保證靶抗原的豐度與

4、純度。最后鑒定經(jīng)過(guò)純化濃縮處理后的抗原是否符合進(jìn)一步研究的要求。
　　1.2、抗原固化:
　　以PBS緩沖液系統(tǒng)稀釋提取抗原至合適濃度，固定于NC膜上;加入待測(cè)不同稀釋度的陽(yáng)性標(biāo)本，根據(jù)熒光強(qiáng)度調(diào)整緩沖液成分。對(duì)固化過(guò)程中的環(huán)境條件，分別在濕度45％、50％、55％和60％進(jìn)行，以劃線粗細(xì)均勻，無(wú)明顯擴(kuò)散、無(wú)明顯疏水斑為佳;在穩(wěn)定性能上，分別保存1、3、5、7、10天，用陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)比較熒光強(qiáng)度。
　　2、熒光蛋白與抗

5、體的結(jié)合
　　生物素標(biāo)記鼠抗人IgG抗體:用PBS溶液將待標(biāo)記抗體稀釋至相應(yīng)濃度，放入適當(dāng)?shù)碾x心管中;DMF將生物素溶解至相應(yīng)濃度，加入待標(biāo)記抗體中，充分反應(yīng)后，根據(jù)反應(yīng)體系大小，加入一定量的0.1M的NH4Cl，終止標(biāo)記。4℃透析除去多余的生物素和NH4Cl，透析好的標(biāo)記抗體放入-20℃長(zhǎng)期保存，或4℃保存近期實(shí)驗(yàn)備用。
　　鏈霉親和素標(biāo)記熒光蛋白:從GeneBank中調(diào)取鏈霉親和素基因sa、藻藍(lán)蛋白β亞基cpcB、裂合酶

6、基因alr0617、藻紅膽素合成酶基因ho1、pebA和pebB的序列，設(shè)計(jì)引物，以藻總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取目的片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，選擇同時(shí)攜帶鏈霉親和素與藍(lán)藻蛋白cpcB的融合基因，以及Histag標(biāo)簽。通過(guò)培養(yǎng)含有質(zhì)粒的大腸工程菌，進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)，鑒定及純化，獲取鏈霉親和素標(biāo)記熒光蛋白。
　　熒光蛋白與抗體結(jié)合能力檢測(cè):將生物素標(biāo)記鼠抗人IgG抗體包被在96孔板，加入一定濃度的鏈霉親和素標(biāo)記熒光蛋白，通過(guò)微孔板檢測(cè)儀

7、檢測(cè)熒光強(qiáng)度檢測(cè)鏈霉親和素標(biāo)記熒光蛋白與鼠抗人IgG抗體結(jié)合能力。
　　3、測(cè)試卡的制備及組裝
　　(a)樣品墊，以玻璃纖維膜為載體，經(jīng)樣品墊處理液浸泡處理，烘干;(b)熒光蛋白結(jié)合墊，以玻璃纖維膜為載體，經(jīng)結(jié)合墊處理液浸泡處理，烘干，將熒光蛋白經(jīng)緩沖液稀釋后，均勻噴在纖維膜上，烘干;(c)生物素化鼠抗人IgG抗體結(jié)合墊，以玻璃纖維膜為載體，經(jīng)結(jié)合墊處理液浸泡處理，烘干，將生物素化鼠抗人IgG抗體經(jīng)緩沖液稀釋后，均勻噴在纖維

8、膜上，烘干;(d)NC膜，結(jié)合有檢測(cè)用固相抗原（檢測(cè)線T）和質(zhì)控用IgG抗體（質(zhì)控線C;本研究dsDNA系統(tǒng)用羊抗兔IgG、ANA系統(tǒng)用羊抗鼠IgG），分別將抗原和羊抗兔（鼠）IgG抗體經(jīng)緩沖液稀釋后，用劃膜儀均勻劃至NC膜上，烘干;(e)吸水墊(f)底板，PS底板，帶有不干膠，作為各成分粘貼的載體;上述(a)-(e)組分按順序和層疊次序粘貼于PS底板上，切為4mm寬條狀，得到測(cè)試條;(g)卡殼:依據(jù)測(cè)試條的組分分布設(shè)計(jì)模具，塑料成型制

9、成卡殼;將測(cè)試條裝入其中，完成測(cè)試卡制備。
　　4、試劑盒反應(yīng)條件優(yōu)化及性能評(píng)價(jià)
　　通過(guò)優(yōu)化篩選合適的抗原抗體，優(yōu)化抗原抗體反應(yīng)濃度、反應(yīng)時(shí)間、緩沖液體系、加樣體積等參數(shù)，提高試劑盒準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，并形成穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝。對(duì)試劑盒進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，主要指標(biāo)為:線性范圍、精密度、靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。通過(guò)現(xiàn)有檢測(cè)方法和研制的快速篩查測(cè)試卡檢測(cè)結(jié)果相比較，評(píng)價(jià)結(jié)果的一致性，評(píng)價(jià)抗核抗體快速篩查試劑盒的臨床使

10、用效果。
　　結(jié)果:1、抗ds-DNA抗體檢測(cè)試劑盒研制開(kāi)發(fā)
　　1.1、生物素標(biāo)記dsDNA抗原(Biotin-dsDNA)的制備:選擇pGEM-T載體，pb3433，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)18h集菌后用堿裂解法提取其質(zhì)粒DNA。使用限制性核酸內(nèi)切酶將dsDNA切成具有粘性末端（游離氨基-NH2）的線性dsDNA，按照5mg/mL生物素酰肼水溶液∶5％戊二醛∶dsDNA水溶液=5∶6∶10比例混合攪勻，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑把活化的BS

11、A與具有游離氨基的線性dsDNA連接，形成dsDNA-BSA包被抗原。
　　1.2、熒光探針制備:選擇Merck Millipore Corporation公司的熒光微球，完成鼠抗人IgG與熒光微球偶聯(lián)優(yōu)化，最終確定將活化好的熒光微球調(diào)節(jié)pH值到7.2-7.4，加入抗體∶微球比例為1∶6，30℃反應(yīng)30min性能為最佳。
　　1.3、反應(yīng)條件優(yōu)化、性能評(píng)價(jià)及臨床比對(duì)分析:確定樣本稀釋比例為1∶49（稀釋50倍）本底抗干擾能力

12、及靈敏度陰陽(yáng)性符合率最佳。其檢測(cè)范圍為5.0-600.0IU/mL。批內(nèi)精密度為8.50％，批間精密度為8.58％，分析靈敏度（檢測(cè)低限）為3.22IU/mL，測(cè)試條穩(wěn)定性在2～8℃環(huán)境里可存放12個(gè)月。通過(guò)樣本測(cè)試比對(duì)分析，與廣州南杰生物技術(shù)有限公司抗雙鏈DNA抗體定量檢測(cè)試劑盒（ELISA方法）之間具有很好的一致性，符合率＞95％，其可較好的滿足臨床使用的要求。
　　2、抗核抗體六聯(lián)檢測(cè)試劑盒研制開(kāi)發(fā)
　　2.1、抗原制

13、備:通過(guò)基因合成所需的蛋白類(lèi)核抗原，并成功進(jìn)行表達(dá)鑒定。
　　在NCBI上查詢臨床常見(jiàn)的人自身抗原的堿基序列和氨基酸序列，運(yùn)用軟件預(yù)測(cè)抗原表位，選擇抗原表位并對(duì)密碼子進(jìn)行偏嗜性改造，采用人工合成方法合成抗原表位序列并插入至原核表達(dá)載體pET30a中。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白用鎳離子親和層析柱純化，用熒光免疫法測(cè)定重組蛋白活性。
　　2.2、抗原固定:對(duì)6種抗原52-kD Ro/SSA、

14、rRNP、Jo-1、SmD1、Scl-70 SSB-La進(jìn)行固定，6種抗原按1∶1∶1∶1∶1∶1混合均勻，在50℃烘箱烘干6小時(shí)，固定效果最佳。
　　2.3、熒光探針制備:鼠抗人IgG生物素標(biāo)記條件優(yōu)化，確定生物素:標(biāo)記抗體=0.25∶1，30℃水浴30min，PH=7.2-7.4標(biāo)記效果最穩(wěn)定。對(duì)生物素標(biāo)記抗體濃度及熒光蛋白濃度比例進(jìn)行了調(diào)試，確定了最佳的配比濃度（生物素標(biāo)記抗體濃度為0.4ug/mL∶熒光蛋白濃度為0.6U/

15、L）30℃反應(yīng)30min性能為最佳。
　　結(jié)論:1、本課題分析基因組雙鏈DNA由于分子量過(guò)大容易導(dǎo)致NC膜層析堵塞，樣本無(wú)法層析;而進(jìn)行酶切處理容易導(dǎo)致分子大小不均一，批間差異可控度低等情況，最后選取低分子量的質(zhì)粒為標(biāo)記對(duì)象，采取堿裂解法提取。其純度高，分子大小均一，批間重復(fù)性可控性好。再經(jīng)過(guò)純化、鑒定及固化、熒光蛋白與抗體的結(jié)合、測(cè)試卡的制備及組裝、試劑盒反應(yīng)條件優(yōu)化及性能評(píng)價(jià)四項(xiàng)研究后成功研制了抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體

16、檢測(cè)試劑盒（熒光免疫層析法）。該方法可以在15分鐘內(nèi)完成檢測(cè)。確定樣本稀釋比例為1∶49（稀釋50倍）本底抗干擾能力及靈敏度陰陽(yáng)性符合率最佳。其檢測(cè)范圍為5.0-600.0IU/mL。批內(nèi)精密度為8.50％，批間精密度為8.58％，分析靈敏度（檢測(cè)低限）為3.22IU/ml，試紙條穩(wěn)定性盒在2～8℃環(huán)境里可存放12個(gè)月。通過(guò)樣本測(cè)試比對(duì)分析，與廣州南杰生物技術(shù)有限公司抗雙鏈DNA抗體定量檢測(cè)試劑盒（ELISA方法）之間具有很好的一致性，

17、符合率達(dá)到95％，其可較好的滿足臨床使用的要求。
　　2、應(yīng)用基因工程方法利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了人自身抗原52-kDRo/SSA，rRNP，Jo-1，SmD1，Scl-70以及SSB-La等六種抗原。再經(jīng)過(guò)純化、鑒定及固化、熒光蛋白與抗體的結(jié)合、測(cè)試卡的制備及組裝、試劑盒反應(yīng)條件優(yōu)化等初步研制了抗核抗體六聯(lián)免疫層析檢測(cè)方法。該方法可以在15分鐘內(nèi)完成檢測(cè)。確定樣本稀釋比例為1∶99（稀釋100倍）本底抗干擾能力及靈敏度陰陽(yáng)性符