基于聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的陽離子納米載體及其對siRNA的體內外遞送功效.pdf

1、小RNA干擾(siRNA)技術是提高抗腫瘤效果的新途徑，但siRNA體內效果的發(fā)揮依賴于載體的有效遞送。聚陽離子是一類倍受關注的具有優(yōu)良性能的siRNA非病毒載體，但納米遞送系統(tǒng)需要協(xié)調發(fā)揮siRNA負載、輸運和釋放功能，而這些功能的協(xié)調發(fā)揮取決于遞送系統(tǒng)的多功能組裝和結構控制。為了探討聚陽離子載體的理想結構并揭示其作用機理，在前期研究基礎上，本文以聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)為聚陽離子段，以聚己內酯(PCL)為疏水段，P

2、EG為親水段，研究了嵌段、接枝結構的兩親性聚合物結構與其功能性的關系；還探討了PDMAEMA修飾的介孔硅以及溫敏非離子型納米載體體系的siRNA遞送功效。
　　首先，本文合成了聚乙二醇-聚己內酯-聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(mPEG-PCL-b-PDMAEMA, PECbD)嵌段共聚物以及聚乙二醇-嵌段-(聚己內酯-接枝-聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(mPEG-PCL-g-PDMAEMA, PECgD)梳型聚合物，并通過自組裝制備了兩

3、種聚合物納米粒(NPs)載體，用于研究體外和體內遞送siRNA的功效。表征了PECbD NPs/siRNA和PECgD NPs/siRNA復合物的理化參數(shù)，如粒徑、zeta電勢等。在HeLa-Luc細胞上評價了其體外毒性、細胞內吞以及基因沉默效率。通過共聚焦顯微鏡觀察了兩種復合物的內涵體逃逸以及細胞內分布情況。分別用小鼠和荷瘤小鼠研究了載體介導的siRNA體內分布情況。在相同的DMAEMA聚合度和N/P下，PECgD NPs/siRNA

4、復合物比PECbD NPs/siRNA復合物表現(xiàn)出更高的zeta電勢，導致更多的siRNA被釋放到細胞質中，進而產(chǎn)生了更好的熒光素酶及l(fā)amin A/C沉默效率。組織成像以及冰凍切片觀察結果表明, PECgD納米粒比PECbD納米粒能夠更好的遞送siRNA到達肺、肝、胰腺和皮下接種的HeLa腫瘤組織中。同時，PECgD納米粒表面較短的PDMAEMA鏈更利于從機體內排出，降低毒副作用。
　　為了進一步發(fā)展聚乙二醇-嵌段-(聚己內酯-

5、接枝-聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)作為siRNA載體的能力，在此基礎上，本文通過在聚乙二醇化的聚己內酯(PCL)和接枝的聚甲基丙烯酸二甲氨基(PDMAEMA)之間，引入對細胞內強還原環(huán)境敏感的二硫鍵，制備出一種膠束型的可響應細胞內還原環(huán)境脫殼的納米粒。由PECssD自組裝成的納米粒含有生物可降解的PCL內核、PEG保護層和可斷裂的聚陽離子殼層。該納米粒能夠與siRNA形成穩(wěn)定的膠束復合物PECssD/siRNA，可以延長siRNA在體內的

6、存留時間，提升其在腫瘤部位的聚集，并且更利于內吞。特別地，二硫鍵在腫瘤細胞內高濃度的谷胱甘肽等還原物質存在下，在細胞內斷裂，導致PDMAEMA/siRNA多聚物從聚乙二醇化的聚己內酯內核上脫落，進而促進了內涵體逃逸以及siRNA的有效釋放。因此，siRNA在細胞質中的含量大大增加，并且提高了siRNA的基因沉默效率。此外，在接種HeLa-Luc腫瘤的裸鼠模型上，通過系統(tǒng)給藥的方式注射攜帶siPlk1(特異性靶向Polo樣激酶1的siRN

7、A)的該納米粒，產(chǎn)生了良好的腫瘤抑制效果，證明該陽離子可斷裂的PECssD納米?？蓾M足體內多級siRNA遞送過程的需要。另外，本文還證明了PECssD/siRNA復合膠束的疏水內核能夠包載疏水性抗癌藥物紫杉醇，未來可以進一步用于siRNA和藥物的協(xié)同給藥治療。
　　盡管上述PDMAEMA基的梳型聚合物納米粒具有較好的siRNA體內外遞送效果，但存在一定的毒性。因此，為了降低由陽離子載體帶來的毒副作用，本文還采用了不同的策略設計制備

8、了兩種新型的siRNA遞送系統(tǒng)。
　　對于siRNA載體而言，易于制備和較低制作成本的低毒高效載體一直是人們追求的目標。為達到這一目的，本文制備了一種聚陽離子-介孔硅雜化納米粒(ssCP-MSNs)。通過在介孔硅內外表面吸附甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)，并用含二硫鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)DMAEMA，使其原位聚合得到納米粒，對該納米粒進行了體外和體內評價。所合成的ssCP-MSNs粒徑為100-150 nm，含有10 nm的孔徑，

9、且表面的正電荷為27 mV。該納米粒具有較強的siRNA負載能力，能夠促進細胞內吞，并增加細胞質中siRNA的含量。此外，由二硫鍵交聯(lián)的PDMAEMA段，在響應細胞內還原環(huán)境而斷裂后，引發(fā)了PDMAEMA從ssCP-MSNs上的脫離，促進了siRNA在細胞內的釋放。因此，在HeLa-Luc細胞上觀察到了很強的基因沉默效率，與Lipofectamine2000相當。特別值得指出的是，與Lipofectamine2000相比，ssCP-MS

10、Ns表現(xiàn)出更強的生物相容性，在HeLa-Luc細胞上沒有毒性，甚至能夠促進細胞增殖。體內分布實驗證明，在通過靜脈注射后，ssCP-MSNs能夠延長siRNA在體內的存留時間，并且聚集在腎上腺、肝、肺、脾、腎、心臟和胸腺中。此外，ssCP-MSNs能夠通過靜脈注射遞送siRNA至腫瘤，并且在接種HeLa-Luc腫瘤的裸鼠模型上取得了顯著的腫瘤抑制效果。但體內長循環(huán)效果仍有待提高。
　　眾所周知，陽離子載體的毒性通常是由于較強的正電荷

11、引起的細胞毒性。因此，本文采用的第二種降低載體毒性的策略就是開發(fā)一種不帶正電荷的遞送系統(tǒng)。本文用聚乙二醇(mPEG)嵌段聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)(mPEG-PNIPAM)、3β-(N,N-二甲基氨基乙基)-氨基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)，通過雙乳化溶劑揮發(fā)法成功設計制備了一種溫敏性釋放siRNA的納米遞送系統(tǒng)。該納米粒的zeta電勢為-3.5±1.3 mv。冷擊會改變該納米粒的形貌和尺寸，進而促進siRNA從納米粒中的釋放