組織蛋白酶L與蘋果酸對牛背最長肌肌內(nèi)結(jié)締組織特性與剪切力的影響.pdf

1、在結(jié)構(gòu)上影響肉剪切力值的主要成分為肌原纖維蛋白和結(jié)締組織。目前，有關(guān)剪切力值的研究大多集中在肌原纖維的變化上，從結(jié)締組織層面探討牛肉剪切力值的研究較少。在動物生理成熟過程以及脂肪沉積過程中肌內(nèi)結(jié)締組織中成熟交聯(lián)、蛋白多糖的變化是否會對結(jié)締組織特性產(chǎn)生影響，進而影響牛肉剪切力值未見系統(tǒng)報道。組織蛋白酶對于肌纖維的降解存在爭議，而其對結(jié)締組織的弱化機制更是鮮有報道。有機酸可以弱化結(jié)締組織，但作用機理未見系統(tǒng)報道?；谌缟蠁栴}，本研究從膠原蛋

2、白、成熟交聯(lián)入手，探索了不同花紋等級和不同齒齡下結(jié)締組織特性和剪切力值的關(guān)系;采用SDS-PAGE、Western-blot、掃描電鏡、透射電鏡、光鏡、紅外光譜、CD光譜、DSC技術(shù)，觀察組織蛋白酶L和蘋果酸處理對肌原纖維蛋白、結(jié)締組織的弱化現(xiàn)象，具體研究內(nèi)容如下。
　　1.牛背最長肌肌內(nèi)結(jié)締組織中成熟交聯(lián)、蛋白多糖、糖胺聚糖與結(jié)締組織特性和剪切力值關(guān)系
　　在齒齡相同情況下，隨著牛背最長肌花紋等級的增加，肌內(nèi)結(jié)締組織中成熟

3、交聯(lián)含量、核心蛋白聚糖(decorin)和糖胺聚糖(GAGs)的含量逐漸降低，從而導致膠原蛋白性質(zhì)發(fā)生變化，膠原蛋白的熱溶解性升高，牛肉剪切力值降低。掃描電鏡表明在肌內(nèi)脂肪較多的牛背最長肌中膠原纖維分散成絲狀，結(jié)構(gòu)較松散。在花紋等級相同情況下，隨著生理成熟度增加（0、1、2、3和4對永久門齒），肌內(nèi)成熟交聯(lián)含量、核心蛋白聚糖和糖胺聚糖的含量也隨之增加，膠原蛋白熱溶解性降低，剪切力值增大;膠原纖維排列緊密，呈片狀或者簇狀分布，結(jié)構(gòu)緊密。多

4、元統(tǒng)計結(jié)果表明，成熟交聯(lián)含量、蛋白多糖和糖胺聚糖含量與結(jié)締組織熱溶解性顯著負相關(guān)，與剪切力值顯著正相關(guān);牛肉剪切力值的大小首先取決于結(jié)締組織中膠原蛋白的熱溶解性、成熟交聯(lián)、蛋白多糖和糖胺聚糖含量，其次取決于結(jié)締組織中膠原蛋白的含量。
　　2.組織蛋白酶L降解肌原纖維蛋白和結(jié)締組織的研究
　　通過酸化、硫酸銨沉降、透析、濃縮、DEAE-Sephacel、Sephacryl S-100、SP SepharoseFast Flow

5、、Blue Sepharose Fast Flow和ConA Sepharose4B層析，純化得到牛胰臟組織蛋白酶L，其分子量約為30 kDa，最適pH為5.5。SDS-PAGE顯示，組織蛋白酶L可以水解肌球蛋白重鏈(MHC)、肌鈣蛋白T、原肌球蛋白以及肌球蛋白輕鏈(MLC1);肌動蛋白、α-肌動素、肌間線蛋白、肌鈣蛋白Ⅰ降解不明顯。透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶L主要破壞肌原纖維A帶區(qū)域（主要是MHC），對于Z線及附近蛋白(肌動蛋白，骨

6、架蛋白）降解能力較弱，這與鈣激活酶的水解機制不同。圓二色譜研究表明，隨著肌原纖維蛋白的水解，肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對含量下降了13.2％,β-折疊含量增加了108.6％。
　　組織蛋白酶L可使肌內(nèi)結(jié)締組織的熱變性溫度顯著降低。未處理組初始變性溫度To為60.63℃，在pH5.0和pH5.5的檸檬酸緩沖溶液中，其To值分別降低至57.87℃和59.73℃。在pH5.0的酶處理組，經(jīng)過36 h酶解處理后To值降低至41

7、.41℃(P＜0.05)。而在pH5.5的酶處理組，To值降低了3.16℃(P＜0.05)。對于峰值變性溫度Tp，在pH5.0和36h條件下，組織蛋白酶L使峰值變性溫度Tp由65.38℃降低至43.79℃（P＜0.05）;而在pH5.5、36 h處理組中，Tp降低至60.79℃（P＞0.05）。這表明，pH越低，組織蛋白酶L對結(jié)締組織降解作用越明顯。SDS-PAGE表明組織蛋白酶L對膠原蛋白的水解位點不在α鏈的三螺旋區(qū)，而在端肽區(qū)。此外

8、，組織蛋白酶L可以降解蛋白多糖，反應體系pH越低，組織蛋白酶水解效率越高。膠原蛋白端肽區(qū)和蛋白多糖的水解共同改變了結(jié)締組織的性質(zhì)，從而影響牛肉的剪切力值。
　　3.蘋果酸影響牛肉肌內(nèi)結(jié)締組織性質(zhì)及其嫩化牛肉研究
　　蘋果酸可降低牛背最長肌剪切力值和肌內(nèi)膠原蛋白的含量。蘋果酸處理24 h后，肌內(nèi)膠原蛋白含量由空白組中4.7 mg/g逐漸降低至3.5 mg/g，熱溶解性由空白組的17％上升至24％。組織學觀察表明，酸處理使得初級

9、肌束膜和次級肌柬膜的厚度都有所減小，24 h后，初級肌束膜發(fā)生一定程度破壞。與此同時，結(jié)締組織的初始變性溫度和峰值變性溫度（To和TP）均顯著降低，分別由未處理組的60.63℃和65.38 C降低至37.55℃和40.15℃(P＜0.05)。蘋果酸使結(jié)締組織中的蛋白多糖逐步解離。衰減全反射-傅里葉紅外光譜(ATR-FTIR)結(jié)果表明，酸處理后膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)變化不明顯，僅310-螺旋、反向聚集片與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)發(fā)生較小轉(zhuǎn)化;這可能與核心蛋