飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像研究.pdf

1、雙光子熒光顯微成像技術(shù)作為成像領(lǐng)域最重要的發(fā)明已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物研究等各個(gè)領(lǐng)域。相比于共聚焦顯微成像技術(shù)，雙光子熒光產(chǎn)生的非線性本質(zhì)使得雙光子顯微成像技術(shù)具有高信噪比、高分辨率、光漂白區(qū)域小等優(yōu)點(diǎn)。此外，雙光子顯微成像技術(shù)使用的飛秒激光光源處于近紅外波段，這一波段的光對(duì)生物樣品的光損傷小、穿透能力強(qiáng)，因此雙光子顯微成像技術(shù)不僅適合于長(zhǎng)時(shí)間的生物組織研究還有較大的成像深度。本文對(duì)雙光子熒光顯微成像理論進(jìn)行了分析，自行搭建了一套雙光子顯微成

2、像系統(tǒng)，設(shè)計(jì)編寫了雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的控制軟件，利用該系統(tǒng)進(jìn)行了雙光子熒光顯微成像研究，并將其應(yīng)用于生物領(lǐng)域。本文的研究工作主要從以下的幾個(gè)方面進(jìn)行。
　　理論方面，對(duì)雙光子熒光產(chǎn)生的過程進(jìn)行了分析，推導(dǎo)了任意時(shí)間間隔內(nèi)的雙光子熒光強(qiáng)度的時(shí)間平均公式，通過公式證明了超短脈沖激光器用于雙光子激勵(lì)的優(yōu)勢(shì)。推導(dǎo)了雙光子熒光的空間光強(qiáng)分布的公式，將其與單光子熒光效應(yīng)的空間光強(qiáng)分布進(jìn)行對(duì)比，lq分析了雙光子熒光顯微成像的優(yōu)勢(shì)。
　

3、　軟件方面，設(shè)計(jì)編寫了雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的控制成像軟件，包括計(jì)算機(jī)控制模塊、機(jī)械掃描模塊、圖像采集和處理模塊。然后對(duì)影響機(jī)械掃描位置精度的因素進(jìn)行了討論，結(jié)果表明為了保證平移臺(tái)的位置精度，設(shè)置系統(tǒng)的分辨率為1μm。最后討論了單次采集與多次采集以及不同的像素時(shí)間間隔對(duì)成像結(jié)果的影響，結(jié)果表明，當(dāng)選擇多次采集并設(shè)置像素時(shí)間間隔在120-160ms之間時(shí)，成像結(jié)果不失真而且信噪比更高。
　　實(shí)驗(yàn)上，首先利用飛秒激光作為光源對(duì)不同濃度

4、的Rhodamine B溶液的雙光子熒光光譜進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果表明隨著溶液濃度的增加，雙光子熒光光譜中心波長(zhǎng)逐漸增加并向其最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)610nm處靠近。然后利用自行搭建的雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)對(duì)Rhodamine B樣品進(jìn)行了雙光子熒光顯微成像和透射成像研究，其成像結(jié)果的對(duì)應(yīng)性證明了該系統(tǒng)成像的正確性，并通過對(duì)不同層面Rhodamine B樣品的掃描得到了Rhodamine B樣品的三維圖像。最后，利用該成像系統(tǒng)對(duì)生物細(xì)胞進(jìn)行了雙光子熒