發(fā)酵液中（-）莽草酸和（-）奎尼酸的分離純化研究.pdf

1、(-)莽草酸和(-)奎尼酸是非常重要的藥物化合物的合成原料，在化工、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。因此，對(duì)(-)莽草酸和(-)奎尼酸產(chǎn)量的提高及相關(guān)產(chǎn)品的分離和純化的研究有著重要的意義。本文針對(duì)發(fā)酵液中(-)莽草酸和(-)奎尼酸含量的檢測(cè)及相關(guān)產(chǎn)品的分離純化進(jìn)行了研究。
　　本文建立了一種LC-MS法同時(shí)測(cè)定(-)莽草酸和(-)奎寧酸含量的方法。以C18為色譜柱，以甲醇-2 mM/L乙酸銨(1:99，v/v)并用乙酸調(diào)pH=2.

2、8的溶液為流動(dòng)相；柱溫：300C；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20ul；UV檢測(cè)波長(zhǎng)：216nm。(-)莽草酸和(-)奎寧酸的量與峰面積有良好的線性關(guān)系：(-)莽草酸y=55.662x+880.66，線性范圍36-504ug/mL，R2=0.9980，檢測(cè)限LOD(S/N=3)0.678ug/mL，定量限(LOQ，S/N=10)53.256ug/mL，精密度（日內(nèi)、日間）RSD<10，準(zhǔn)確度為0.9989，加標(biāo)回收率99.58％

3、；(-)奎寧酸y=0.58028x+0.93574，線性范圍25.25-353.5ug/mL，R2=0.9996，檢測(cè)限LOD(S/N=3)5.744ug/mL，定量限(LOQ，S/N=10)26.093，精密度（日內(nèi)、日間）RSD<10，準(zhǔn)確度0.9855，加標(biāo)回收率98.75%。用質(zhì)譜對(duì)(-)莽草酸和(-)奎寧酸進(jìn)行定性檢測(cè)：負(fù)離子模式：135.0 V、300℃；總離子掃描(TIC) m/z=100-500；單離子檢測(cè)(SIM)：(

4、-)莽草酸 m/z172.9,(-)奎寧酸 m/z191.1。結(jié)果證明該方法可以準(zhǔn)確快速高效的測(cè)定發(fā)酵液中(-)莽草酸和(-)奎寧酸的含量，并為其相關(guān)產(chǎn)品的分離純化研究提供依據(jù)。
　　通過(guò)717陰離子交換樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品(-)莽草酸吸附的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)態(tài)穿透曲線實(shí)驗(yàn)、吸附熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究考察了717型陰離子交換樹(shù)脂對(duì)(-)莽草酸的吸附特性，確立了從發(fā)酵液中吸附分離(-)莽草酸的操作條件。通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)對(duì)樹(shù)脂吸附(-)莽草酸的速率

5、控制模型進(jìn)行了分析。用動(dòng)態(tài)吸附的方法測(cè)定了流出曲線，研究了不同操作參數(shù)（流速、初始料液(-)莽草酸的濃度、操作溫度和料液pH值）對(duì)吸附的影響，并采用Adams-Bohart模型，Thomas模型和Yoon-Nelson模型對(duì)穿透曲線進(jìn)行模擬分析，結(jié)果表明Thomas模型和Yoon-Nelson模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有極好的關(guān)聯(lián)性。較佳的吸附條件為：料液的流速為1.0 mL/min,操作溫度為室溫，料液pH值為7.5。通過(guò)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心、過(guò)濾、

6、調(diào)節(jié)pH值的方法獲得了過(guò)濾液，并通過(guò)717陰離子交換樹(shù)脂對(duì)過(guò)濾液中的(-)莽草酸進(jìn)行特異性吸附，再通過(guò)95%乙醇進(jìn)行洗滌、洗脫的方法從飽和樹(shù)脂中解吸出(-)莽草酸從而獲得洗脫液，最后通過(guò)濃縮結(jié)晶的方法獲得了(-)莽草酸粗品。
　　粗品中含有(-)莽草酸和(-)奎寧酸兩種重要的化學(xué)物質(zhì)。為了分離出純凈的(-)莽草酸和(-)奎寧酸需要選擇一種合適的溶劑來(lái)構(gòu)建相圖，而相圖是研究和解決相平衡問(wèn)題的重要工具，對(duì)物質(zhì)的分離純化過(guò)程具有指導(dǎo)性的

7、意義。因而本文采用平衡法對(duì)(-)莽草酸在水、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、正庚烷、正己烷、環(huán)己烷、辛烷和在(水+乙醇)二元溶劑混合物中在不同溫度下的溶解度及(-)奎寧酸在水、甲醇、乙醇和（水+甲醇）、（水+乙醇）混合溶劑體系中在不同溫度下的溶解度進(jìn)行了測(cè)定。并用ideal模型、Apelblat模型、λh模型、willision模型和NTTL模型對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合分析，并通過(guò)修正van’t Hoff方程和Apelblat方程聯(lián)合推導(dǎo)應(yīng)用

8、對(duì)溶解過(guò)程中的相關(guān)熱力學(xué)函數(shù)焓、熵、吉布斯自由能、焓熵貢獻(xiàn)度進(jìn)行了研究分析，從而為相圖的構(gòu)建并用其來(lái)分離純化(-)莽草酸和(-)奎寧酸提供了理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，(-)莽草酸和(-)奎寧酸在不同溶劑中的溶解度隨溫度的升高而增大；在溫度恒定時(shí)，(-)莽草酸和(-)奎寧酸的溶解度隨溶劑極性的增大而增大、(-)莽草酸和(-)奎寧酸在（水+甲醇）、（水+乙醇）二元混合溶劑體系中的溶解度隨甲醇或者乙醇含量的增加而減??；在溶解過(guò)程中△

9、 solH0m、△ solS0m、△ solG0m的值都是正值，說(shuō)明(-)莽草酸和(-)奎寧酸的溶解是吸熱過(guò)程，并且(-)莽草酸和(-)奎寧酸的溶解度隨著溶液標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能的減少而增加。然而ζH≥55.02%說(shuō)明在溶解過(guò)程中溶解焓對(duì)標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能起到主要的貢獻(xiàn)作用。
　　本文通過(guò)恒溫溶解法(靜態(tài)法)分別對(duì)三元體(-)莽草酸+(-)奎寧酸+水和四元體系(-)莽草酸+(-)奎寧酸+乙醇（v～50%、75%）+水在T=(298.15

10、,318.15,333.15,348.15) K下的溶解度數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)定，得到了三元和四元固液相平衡數(shù)據(jù)，并繪制出相應(yīng)體系在多個(gè)溫度下的三元和四元體系恒溫、變溫相圖。并以此作為(-)莽草酸和(-)奎寧酸結(jié)晶分離方法的理論分析依據(jù)，為連續(xù)循環(huán)分離純化工藝的優(yōu)化提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)在任意一個(gè)溫度下，三元、四元體系均存在1個(gè)共飽和點(diǎn)，2條相平衡曲線，3個(gè)結(jié)晶區(qū)：(-)莽草酸結(jié)晶區(qū)、(-)奎寧酸結(jié)晶區(qū)和(-)莽草酸+(-)奎寧酸結(jié)

11、晶區(qū)。(-)莽草酸和(-)奎寧酸的溶解度隨溫度的增加而增大，共飽和點(diǎn)也隨溫度的增加而上移，不同量的乙醇的加入改變了(-)莽草酸和(-)奎寧酸在同一溫度下的共飽和點(diǎn)。在同一溫度下，(-)莽草酸的平衡濃度隨著(-)奎寧酸濃度的增大而減小；在同一(-)奎寧酸平衡濃度下，(-)莽草酸的平衡濃度隨著溫度的升高而增大。(-)莽草酸和(-)奎寧酸的結(jié)晶區(qū)隨溫度的減小而增大。在同一溫度下(-)莽草酸的結(jié)晶區(qū)比(-)奎寧酸的結(jié)晶區(qū)大。
　　通過(guò)對(duì)變

12、溫相圖的處理和應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，(-)莽草酸+(-)奎寧酸+水三元體系變溫相圖在連續(xù)循環(huán)分離(-)莽草酸和(-)奎寧酸的操作中效率較低、能量消耗較大。(-)莽草酸+(-)奎寧酸+乙醇（v～75%）+水四元體系變溫相圖中(-)莽草酸和(-)奎寧酸的共飽和點(diǎn)幾乎在一條通過(guò)原點(diǎn)的直線上，說(shuō)明該變溫相圖不適合用于(-)莽草酸和(-)奎寧酸的分離操作。(-)莽草酸+(-)奎寧酸+乙醇（v～75%）+水四元體系變溫相圖和(-)莽草酸+(-)奎寧酸+乙醇(v