不飽和透明質酸二糖的制備和活性研究.pdf

1、透明質酸(hyaluronicacid，HA)，又名玻璃酸，是由D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)雙糖單位通過交替的β-1，3和β-1，4糖苷鍵連接而成的線性高分子酸性粘多糖。HA是構成細胞外基質(ECM)的主要成分，是皮膚、玻璃體、關節(jié)滑液和軟骨組織的重要成分，具有獨特的理化性質和生物學功能。研究顯示，HA在維持組織完整性以及在感染、損傷、胚胎發(fā)育過程中的組織形成和重塑方面發(fā)揮重要作用。
　　 1934

2、年美國科學家Meyer和Palmer首先從牛眼玻璃體中分離得到HA，隨著人們對HA結構、性質和生理功能研究的不斷深入，其在醫(yī)藥、化妝品、食品等領域的應用越來越廣泛。研究表明，不同相對分子質量(Mr)的HA具有不同甚至截然相反的活性。近年來，國內外研究者對HA降解及其降解產物的研究不斷增多。透明質酸寡糖(oligosaccharidesofhyaluronan，簡稱o-HA)為Mr小于10000Da、單糖殘基數量在2～40之間的HA分子片

3、段，因其在促進傷口愈合、促血管生成、免疫調節(jié)以及抗腫瘤等方面具有十分重要的作用日益受到研究者的重視。o-HA的制備方法主要包括化學降解、酶降解以及生物合成法。其中，酶解制備因反應條件溫和、降解效率高等特點比較適用于o-HA的制備。
　　 本課題重點研究了不飽和透明質酸二糖(unsaturatedhyaluronandisaccharide，△DiHA)的制備純化、結構確證、細胞毒性及相關生物活性。
　　 1、△DiHA的

4、制備
　　 研究了用一種來源于芽孢桿菌的透明質酸裂解酶(hyaluronatelyase)制備△DiHA的方法，并根據此種酶降解的特點探討△DiHA的純化方法。然后，通過對△DiHA樣品紫外光譜、質譜、核磁共振氫譜和碳譜的分析確定了△DiHA端基異構體的結構，隨后討論了硫酸咔唑法和HPLC法測定△DiHA含量的方法。
　　 2、△DiHA的細胞毒性
　　 使用小鼠成纖維細胞(L929)評價了△DiHA的細胞毒性。

5、結果顯示，△DiHA孵育后的L929細胞的增殖速率及細胞形態(tài)較陰性對照均沒有明顯變化，即△DiHA對L929細胞沒有細胞毒性。
　　 3、△DiHA對人臍靜脈血管內皮細胞及人角膜上皮細胞增殖的影響
　　 采用MTT法測定了△DiHA對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)及人角膜上皮細胞(HCEC)增殖的影響，并使用流式細胞術檢測了△DiHA對HCEC細胞周期及凋亡的影響。結果顯示，△DiHA具有較強的促進HUVEC增殖的活性，

6、并可明顯促進HCEC的增殖，但對HCEC細胞周期及凋亡沒有顯著影響。
　　 4、△DiHA抗氧化活性研究
　　 研究了不同濃度H2O2刺激HCEC對細胞內活性氧(ROS)水平的影響以及△DiHA是否能夠抑制細胞內ROS水平的升高。結果表明，在一定濃度范圍內，細胞內ROS水平隨培養(yǎng)基中H2O2濃度的升高升高，而在培養(yǎng)基中加入不同濃度△DiHA可一定程度降低由H2O2刺激引起的細胞內ROS水平的升高。
　　 本課題主