殺蟲抗病增效蛋白HaCad1和MgAp1的活性及作用機理.pdf

1、本論文主要著眼于蘇云金芽胞桿菌在殺蟲抗病相關領域的研究,研究內容分別涉及到了該領域的多個方面:包括對具有殺蟲抗病增效作用新基因的發(fā)掘,功能和作用機理研究；具有殺蟲抗病增效作用新基因在蘇云金芽胞桿菌中的功能驗證；還有蘇云金芽胞桿菌遺傳操作方法的改進；以及轉基因Bt工程菌的安全性問題的評估等等。主要研究內容和結果如下:
　　 1)HaCadl對蘇云金芽胞桿菌毒素CrylAc的增效活性及其增效機理
　　 本研究將純化的HaCa

2、dl與CrylAc毒素進行體外復配生測,發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲受體鈣粘蛋白含有毒素結合區(qū)域的片段HaCadl能夠顯著提高殺蟲晶體蛋白CrylAc對棉鈴蟲的殺蟲活性。本研究進一步研究了HaCadl對CrylAc毒素的增效機理,證明體外添加的HaCadl可以在中腸環(huán)境下促進毒素單體的寡聚化,這樣可以提供更多的寡聚化的毒素,提高毒素與第二受體結合的比例,最終起到提高殺蟲活性的功能。
　　 2)蘇云金芽胞桿菌毒素CrylAc與棉鈴蟲受體鈣粘蛋白Ha

3、Cad的相互作用位點
　　 本研究通過構建了一系列的棉鈴蟲鈣粘蛋白毒素結合區(qū)HaCadl的N端和C端的缺失突變體,然后對各缺失突變體采用ligand blot,GST-Pulldown和酵母雙雜交等蛋白質相互作用分析技術研究了它們與CrylAc毒素的結合能力。實驗結果證明HaCadl上能夠與CrylAc蛋白結合的位點位于1401位到1441位之間的40個氨基酸殘基內。進一步對該區(qū)域進行3個氨基酸殘基的丙氨酸掃描突變實驗證明其中的

4、1416FIL1418和1422TGVLSLNFOPTAAMHGMFEF1441多肽對于受體結合毒素是必須的。同時,通過對CrylAc蛋白結構域Ⅱ內的loop-1,loop-2,loop-3和loop-α8的缺失突變體與HaCadl的ligandblot實驗,證明CrylAc蛋白與HaCad結合的區(qū)域位于結構域Ⅱ內的loop-3區(qū)域。最后,通過序列比對,親水性互補分析和三維結構對接模擬進一步證實CrylAc結構域Ⅱ中l(wèi)oop3的區(qū)域44

5、0FSNSSVSII448和受體HaCad上的1423GVLSLNFQP1431區(qū)域是發(fā)生相互作用的核心區(qū)域。
　　 3)稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl誘導植物抗病活性和作用機理
　　 本研究在大腸桿菌中表達和純化了稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl,通過室內盆栽抗病等實驗證明了MgApl具有蛋白類激發(fā)子的功能,能夠誘導包括水稻,番茄和土豆等多種植物產生對多種細菌和真菌病害的抗性。進一步發(fā)現(xiàn)MgApl蛋白能夠誘導番茄葉片中抗病相

6、關酶的積累和活性的顯著提高。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)MgApl蛋白能夠誘導水稻葉片中抗病相關基因PRs表達的上調,而且這種上調現(xiàn)象具有可傳導性和長達15 d的持效期。說明MgApl蛋白誘導植物產生的抗性是一種系統(tǒng)獲得抗性SAR。之后通過對SAR各條信號傳導途徑的標志基因和條信號傳導途徑的突變體等試驗進一步證明了MgApl主要是通過水楊酸途徑來進行SAR的信號傳導。此外還證明MgApl的誘導過程還與鈣離子通道和活性氧的進發(fā)有關。
　

7、　 4)稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl增強AiiA蛋白和ZwA的抗病活性
　　 本研究通過將S-層表面展示系統(tǒng)在蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171中成功表達了稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl,并通過室內盆栽和離體抗病試驗證明了MgApl具有誘導番茄抗病相關酶活性提高和誘導馬鈴薯抗軟腐病等生物學功能。本研究進一步探索了稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl、AiiA蛋白與ZwA之間進行聯(lián)合抗病的可能性。將MgApl、AiiA蛋白的編碼基因s

8、lh-mgap1和pro3a-aiia同時導入到高產ZwA的蠟狀芽胞桿菌UW85中,得到了同時表達MgApl、AiiA蛋白與ZwA的重組菌。室內盆栽結果發(fā)現(xiàn)共表達重組菌獲得了MgApl的誘導活性,Aii活性檢測發(fā)現(xiàn)重組菌也獲得AiiA蛋白對AHLs信號分子的降解活性。同時ZwA活性檢測發(fā)現(xiàn)共表達并不影響重組菌中ZwA的產量。最后,離體抗病實驗證明三者在芽胞桿菌中共表達能夠極大地提高重組菌對軟腐病菌SCG1的防治效果。
　　 6)

9、蘇云金芽胞桿菌工程菌BMB696B和BMB606B的安全性毒理學評估
　　 本研究按照《農藥登記毒理學實驗方法》GB15670-1995上規(guī)定的關于生物農藥的毒理學內容和方法,完成了工程菌BMB606B和BMB696B的急性和亞急性毒性,眼和皮膚刺激性以及過敏性等毒理學試驗。結果證明工程菌BMB696B和BMB606B及其產品對雌、雄性大鼠(Wistar)急性經(jīng)口LD50大于5000 mg/kg,屬低毒類；對雌雄大鼠急性經(jīng)皮LD

10、50大于2000 mg/kg,屬低毒類；對兔眼刺激積分指數(shù)為0,刺激平均指數(shù)48 h后為0,眼刺激強度為無刺激性；對雌雄大鼠經(jīng)過多次致敏和激發(fā)均沒有發(fā)現(xiàn)對封閉群豚鼠有皮膚的致敏反應,屬Ⅰ級弱致敏物；經(jīng)28 d致病性觀察,在經(jīng)口劑量5000 mg/kg情況下,對雌雄Wistar大鼠體重,取食,飲水,血常規(guī)和血清學指標以及器官發(fā)育均無明顯影響,說明兩株工程菌產品對受試動物無致病作用。本研究證明工程菌BMB696B和BMB606B及其產品對所

11、試動物無毒、無刺激性、無致敏性、無致病性,是值得進一步開發(fā)應用的安全可靠的生物殺蟲劑。
　　 6)蘇云金芽胞桿菌野生菌和大質粒高效電轉化體系的建立
　　 本研究通過DNA脫鹽技術處理外源DNA,加入細胞壁弱化劑弱化蘇云金芽胞桿菌的細胞壁,并對各種影響電轉化效率的因素的條件優(yōu)化,建立了一套蘇云金芽胞桿菌的高效電轉化體系。與已報道的最佳的電轉化程序比較,結果證明:本研究優(yōu)化的電轉化系統(tǒng)使BMB171的電轉化效率提高了104倍