新型DNA分子機(jī)器的應(yīng)用及研究.pdf

1、隨著生物學(xué)研究范圍的不斷擴(kuò)展，我們經(jīng)常會(huì)遇到一些無法直接擴(kuò)增的目標(biāo)分子，然而又由于其濃度較低而無法進(jìn)行檢測(cè)，傳統(tǒng)的分析方法不能檢測(cè)含量太低的目標(biāo)物質(zhì)，因此，信號(hào)放大技術(shù)的發(fā)展已成為當(dāng)前生化分析領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向，在生物化學(xué)分析中，常見的信號(hào)放大技術(shù)主要有工具酶信號(hào)放大、金納米信號(hào)放大、生物條碼信號(hào)放大等，這些信號(hào)放大技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、小分子等物質(zhì)的檢測(cè)。本文采用熒光分析方法，構(gòu)建了基于DNA分子機(jī)器、核酸適配體識(shí)別技術(shù)、

2、DNA酶識(shí)別元件引發(fā)的靶替代循環(huán)放大方法以及酶循環(huán)放大方法，實(shí)現(xiàn)了生物活性小分子和基因的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)。主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面:
　　1.構(gòu)建了一種新型的多重循環(huán)的DNA分子機(jī)器，利用等溫循環(huán)鏈置換聚合反應(yīng)，結(jié)合熒光分析方法對(duì)ATP進(jìn)行檢測(cè)。首先，以磁珠作為DNA引物鏈及ATP適體的固載物，適體與ATP結(jié)合釋放出引物鏈，在Klenow聚合酶的作用下，引物鏈雜交延伸釋放熒光探針，同時(shí)形成雙鏈DNA。在雙鏈DNA上設(shè)計(jì)了

3、兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)過內(nèi)切酶的特異性切刻后，釋放兩條引物鏈，并進(jìn)一步引發(fā)鏈置換反應(yīng)，釋放出更多的熒光探針，最終達(dá)到放大信號(hào)的作用。在最佳反應(yīng)條件下，實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)限為1.0×10-8 mol·L-1，可用于實(shí)際樣品細(xì)胞勻漿中ATP的測(cè)定。該方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作方便，靈敏度高且具有良好的選擇性。
　　2.利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和發(fā)卡探針自組裝技術(shù)，設(shè)計(jì)了新穎的循環(huán)放大體系對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行熒光檢測(cè)。首先將目標(biāo)DNA與鎖扣DNA進(jìn)行雜交反

4、應(yīng)，將目標(biāo)DNA結(jié)合到模板上。在T4 DNA連接酶的作用下鎖扣DNA形成環(huán)狀DNA，結(jié)合Phi29 DNA聚合酶的聚合生長(zhǎng)作用，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)形成一條長(zhǎng)的DNA鏈，長(zhǎng)鏈DNA上有多個(gè)重復(fù)的DNA片段可以作為發(fā)卡探針自組裝的引物，反應(yīng)后釋放熒光探針，通過多重循環(huán)放大技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)。
　　3.設(shè)計(jì)了基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的DNA分子機(jī)器，運(yùn)用熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的靈敏度檢測(cè)。該方法利用目標(biāo)DNA與環(huán)狀

5、DNA結(jié)合，在Phi29 DNA聚合酶和dNTPs的作用下發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，生成大量的長(zhǎng)鏈DNA。滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生大量的重復(fù)的DNA片段，該片段與信號(hào)探針結(jié)合后存在Mg2+的剪切位點(diǎn)，當(dāng)體系中加入一端修飾熒光基團(tuán)、一端修飾猝滅基團(tuán)的信號(hào)DNA探針(F/Q)時(shí)，與滾環(huán)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，在Mg2+存在的情況下，能夠識(shí)別特殊位點(diǎn)rA并進(jìn)行剪切，使熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)之間的距離增大，呈現(xiàn)出熒光信號(hào)，通過對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DN