新型DNA聚合酶的基因工程改造及應(yīng)用研究.pdf

1、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是當(dāng)今分子生物學(xué)研究領(lǐng)域最重要的工具之一,在PCR反應(yīng)中,耐熱性DNA聚合酶的活性特點(diǎn)關(guān)系到PCR反應(yīng)的特異性、高效性和忠實性。Taq DNA聚合酶是一種來源于嗜熱菌Thermus aquaticus的高度熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,并以其耐高溫、較高的特異性、靈敏度等優(yōu)良特性被廣泛應(yīng)用在PCR擴(kuò)增中。然而常規(guī)的Taq DNA聚合酶沒有3'→5'核酸外切酶活性,即在PCR反應(yīng)中缺乏校對活性,保真度較之高保真Pfu DNA

2、聚合酶要低很多,且對長片段DNA模板的擴(kuò)增效率也較低。因此,對Taq DNA聚合酶的改性研究成了當(dāng)今PCR研究領(lǐng)域中的重點(diǎn)。
　　 論文旨在運(yùn)用基因工程手段從基因水平改造Taq DNA聚合酶的原始表達(dá)基因,從而獲得一種兼具高效性和保真性的新型DNA聚合酶Taq-omni DNA聚合酶。
　　 首先,運(yùn)用基因工程手段將蛋白Sso7d融合到raq DNA聚合酶中,Sso7d融合蛋白的表達(dá)可加快Taq DNA聚合酶在PCR中的

3、延伸速率以及對PCR抑制劑的抵抗能力。并對重組體進(jìn)行定點(diǎn)突變,改善Taq DNA聚合酶的特異性和PCR擴(kuò)增長度。
　　 其次,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Taq-omni DNA聚合酶,用Ni2+-NTA純化該酶,進(jìn)行SDS-PAGE電泳并結(jié)合基因測序確定Taq-omni DNA聚合酶的分子量的大小。
　　 最后,檢測了Taq-omni DNA聚合酶的部分特性,該酶分子量約為101KDa,耐熱性極強(qiáng),95℃,2h高溫處理后活性仍能保

4、留50％。PCR反應(yīng)的最優(yōu)緩沖體系是:50mmol/LTris-HCl(pH8.2),4mmol/L,MgCl2和0.02%Triton X-100。該酶在PCR中的擴(kuò)增速率較高,擴(kuò)增2.9Kb的DNA模板,Taq-omni DNA聚合酶只需要10s,Taq需要40s,Pfu需要80s),且特異性較好。在常規(guī)PCR條件下,成功擴(kuò)增了長達(dá)5.37Kb的模板DNA。并能成功擴(kuò)增土壤DNA、小鼠血清、76%的高GC含量的DNA等,且對PCR抑