轉(zhuǎn)反義NR基因四倍體金魚草(Antirrhinum majus)的培育.pdf

1、植物體內(nèi)乙烯生理作用的發(fā)揮是通過乙烯生物合成途徑及乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)的。NR基因是與ETR1基因同源的乙烯受體蛋白基因，它對(duì)乙烯的接收和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)直接影響著植株的生理和生長(zhǎng)，影響著植物的抗逆性。NR基因不僅調(diào)控果實(shí)的成熟，而且還與植株的其他生理代謝，生長(zhǎng)發(fā)育有密切的關(guān)系。通過轉(zhuǎn)反義NR基因植株的獲得，可以研究NR基因與植株的生理代謝，植株生長(zhǎng)、發(fā)育和果實(shí)成熟等之間的關(guān)系，鑒定NR基因的作用；還能獲得可用于生產(chǎn)實(shí)踐的耐貯藏、抗性強(qiáng)的新

2、品種或育種材料。 金魚草(Antirrhinum majus)為玄參科多年生草本花卉。其品種多，花色豐富而艷麗，花期長(zhǎng)，是花壇、花境及切花的常用素材。近年來，金魚草已成為遺傳學(xué)和分子生物學(xué)、特別是轉(zhuǎn)座子、花色素發(fā)育與調(diào)控和花型發(fā)育研究的重要經(jīng)典材料。 金魚草基因轉(zhuǎn)化報(bào)道還較少，由于金魚草的無菌苗生長(zhǎng)勢(shì)極弱，從而導(dǎo)致以下胚軸為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)，因下胚軸太小太細(xì)，再加上農(nóng)桿菌的侵染作用，外植體在共

3、培養(yǎng)階段幾乎全部死亡，從而使再生率和轉(zhuǎn)化率大大下降，為金魚草的基因轉(zhuǎn)化工作增加難度。 本研究結(jié)合了多倍體誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因工程兩種技術(shù)，在基因轉(zhuǎn)化前采用培養(yǎng)基中加秋水仙素法進(jìn)行金魚草多倍體的誘導(dǎo)，得到直徑粗于金魚草種子苗下胚軸幾倍的四倍體再生苗；外源基因的轉(zhuǎn)化采用根癌農(nóng)桿菌攜帶反義NR基因與金魚草四倍體再生苗的莖段共培養(yǎng)，將反義NR外源基因?qū)虢痿~草細(xì)胞的染色體組，并通過不定芽進(jìn)行抗性標(biāo)記的篩選，對(duì)部分轉(zhuǎn)基因四倍體進(jìn)行PCR、Sout

4、hern和Northern檢測(cè)，成功獲得抗卡那霉素的四倍體金魚草植株。論文的研究結(jié)果如下： 1、以市場(chǎng)所售的二倍體(2n=2x=16)切花金魚草品種為材料，獲得金魚草的壯苗培養(yǎng)基的配方為1/2MS+BA1 mg/L+IAA0.2 mg/L；幼嫩莖段的分化培養(yǎng)基為MS+BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L；生根培養(yǎng)基的配方為：1/2MS+IBA0.5 mg/L。 2、金魚草四倍體的誘導(dǎo)采用培養(yǎng)基中加秋水仙素法，誘導(dǎo)濃

5、度和時(shí)間分別是0.1％、4 d；對(duì)部分突變體進(jìn)行PCR檢測(cè)和染色體倍性鑒定，表明四倍體金魚草誘導(dǎo)成功。經(jīng)反復(fù)繼代篩選，分離出同質(zhì)的四倍體金魚草。 3、首次將反義NR基因?qū)胨谋扼w金魚草，并獲得了部分轉(zhuǎn)基因突變體。其轉(zhuǎn)化體系如下：以四倍體金魚草的幼嫩莖段為外植體，用OD550值為0.4的農(nóng)桿菌浸染，轉(zhuǎn)入不含卡那霉素壓力再生培養(yǎng)基上黑暗共培養(yǎng)2 d后，再轉(zhuǎn)入含卡那霉素壓力的篩選培養(yǎng)基(MS+BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L

6、+卡那霉素50 mg/L+羧芐青霉素500 mg/L)，通過壓力篩選獲得的抗性株為轉(zhuǎn)基因四倍體金魚草植株。 4、對(duì)轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出一條特異的電泳帶，該片段為35S啟動(dòng)子的保守序列，由此表明外源基因已經(jīng)整合到金魚草細(xì)胞中；Southern檢測(cè)了部分轉(zhuǎn)基因四倍體，35S啟動(dòng)子DNA和轉(zhuǎn)化植株DNA均有雜交信號(hào)，而術(shù)轉(zhuǎn)化植株的DNA無雜交信號(hào)，證明NR基因已被成功轉(zhuǎn)入到金魚草細(xì)胞中；Northern檢測(cè)了部分轉(zhuǎn)基因四倍體，