扇貝異源多倍體與四倍體培育技術研究.pdf

1、1、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)♀×海灣扇貝(Argopecten irradians)♂異源三倍體誘導及細胞遺傳學研究 受精過程熒光顯微觀察表明，選擇充分促熟的親貝，20℃水溫下，遠緣雜交可以順利進行。精子入卵后可以激活卵子完成減數(shù)分裂，進而精卵原核融合，卵裂，早期胚胎能夠正常發(fā)育。觀察初步證實異源精子參與了后代遺傳物質的組成，具備異源多倍體誘導操作的可行性。 以50％的受精卵排出第1極體為誘導時機，以6

2、0 mg/L6-DMAP為誘導劑量，處理15min，平均三倍體誘導率可達88.56％，孵化率可達53.52％。孵化后幼蟲生長緩慢，死亡嚴重。受精后14天殼長僅為148μm左右，遠低于自交對照組(173μm)。14天幼蟲存活率僅0.00067％。 GISH分析表明，誘導獲得的三倍體胚胎其染色體組由2套母本染色體組和1套父本染色體組構成，確為異源三倍體。約2％的分裂相出現(xiàn)母本偏向性染色體轉變。類型包括染色體片段，及整條染色體的遺傳

3、轉變。表明異源基因組并不穩(wěn)定，存在復雜的核-核、核-質相互作用，可能與幼蟲不能成活有關。 2、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)三倍體誘導與培育 嘗試低滲法誘導蝦夷扇貝三倍體，獲得最優(yōu)誘導條件：12℃水溫，以50％的受精卵排出第1極體為處理時機，20‰的鹽度條件處理受精卵20min，D形幼蟲平均三倍體得率可達91.24％，平均孵化率達52.94％。 倍性變化趨勢：大規(guī)模誘導群體在D形幼蟲至2

4、齡成貝期間，以D形幼蟲期三倍體率最高，達50.06％。隨后，三倍體率急劇下降，到4月齡降至12.07％。從4月齡到8月齡三倍體率下降趨于緩慢，至8月齡降至7.27％。8月齡至24月齡成貝期間三倍體率基本穩(wěn)定。 人工誘導三倍體在4月齡至24月齡期間均未表現(xiàn)出生長優(yōu)勢。24月齡成貝，三倍體平均殼高、殼長、殼寬、總重分別比二倍體對照低8.59％、10.33％、8.79％和24.78％。 3、蝦夷扇貝三倍體(P.yessoens

5、is)育性與四倍體培育 三倍體性成熟期比對照晚1月左右。共檢測三倍體個體60只。性腺存在不同程度的發(fā)育，總體水平低下。雄性先于雌性發(fā)育。雄性性腺多為乳白色，個別微泛黃，雌性多為橘紅色，個別顏色較淡。性比基本正常，1齡期雌雄比約1：1.18，2齡期雌雄比約1：1.50。未發(fā)現(xiàn)雌雄同體個體。 雄性三倍體共催產29只，無一排精。電鏡檢測3只雄性性腺，發(fā)現(xiàn)存在大量精子細胞。精核開始濃縮，呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形。部分精子細胞線粒體嵴稀少

6、，甚至呈空泡狀。內質網稀少，未發(fā)現(xiàn)頂體形成，也未發(fā)現(xiàn)成熟精子。 雌性三倍體共催產23只，4只排卵。卵子平均直徑86.65±2.53μm，比二倍體大10.79％，體積大35.99％。相對育性(產卵量)1齡為3％，2齡為4％。熒光顯微觀察表明，三倍體的卵子具有受精能力，與二倍體的精子受精后大多數(shù)能夠類似正常的分裂和發(fā)育。約30％的卵子減數(shù)分裂異常，染色體行為不同步。3n♀×2n♂子代主要為非整倍體，約70％幼蟲倍性介于2n和3n之間

7、，30％介于3n和5n之間。D形幼蟲孵化率僅0.23％，至7日齡未發(fā)現(xiàn)存活幼蟲。 以20％0的鹽度條件處理3n♀×2n♂受精卵20min抑制第1極體釋放，胚胎最高四倍體率達75.12％。幼蟲發(fā)育異常遲緩，約受精后65h到達擔輪期，120h到達D形期，孵化率平均僅0.09％。7日齡存活率僅0.07％。 4、三倍體蝦夷扇貝(P.yessoensis)基因組甲基化水平的MSAP分析 蝦夷扇貝三倍體13只二倍體20只，來

8、源于同一誘導群體。9對引物MSAP擴增共得到7206條條帶，其中甲基化條帶1988條(27.6％)，包括全甲基化1095條(15.2％)，半甲基化893條(12.4％)。 主要結論為：(1)蝦夷扇貝基因組甲基化水平較高。(2)個體間基因組甲基化水平差異較大。(3)三倍化導致蝦夷扇貝基因組甲基化降低。(4)甲基化水平與性別有關。平均總甲基化率：雌性高于雄性。(5)平均總甲基化率：二倍體雌性＞二倍體雄性＞三倍體雌性＞三倍體雄性。(6