低能激光照射對(duì)豬心肌干細(xì)胞增殖及旁分泌作用的影響.pdf

1、目的：
　　心肌干細(xì)胞（cardiacstemcells，CSCs）是心梗后細(xì)胞再生修復(fù)療法的熱點(diǎn)種子細(xì)胞。低能激光照射（low-level laster irradiation，LLLI）已被證實(shí)能夠影響多種體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況及細(xì)胞因子的分泌，但目前尚缺乏LLLI對(duì)心肌干細(xì)胞影響的研究，本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同能量強(qiáng)度低能激光照射對(duì)體外培養(yǎng)的豬心肌干細(xì)胞增殖效率及旁分泌作用的影響。
　　方法：
　　選取成年巴馬小型豬，

2、雌性，體重25-30kg。通過心臟外科手術(shù)經(jīng)右側(cè)小切口鉗取右心耳組織，用組織塊培養(yǎng)法獲取原代心肌干細(xì)胞，以心肌干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，視細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代。選取分選純化后的第3代細(xì)胞行流式檢測鑒定細(xì)胞表型：c-kit、CD34、CD45、CD31、CD90、Lineage；行Western Blot檢測心肌早期特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4的表達(dá)；誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后行免疫熒光檢測CX43、cTnT、α-SMA、vWF，以觀察心肌干細(xì)

3、胞的多向分化潛能；并以不同能量密度（0 J/cm2,0.50 J/cm2,0.75 J/cm2,1.00 J/cm2,3.00 J/cm2,5.00 J/cm2）的低強(qiáng)度激光（660nm）照射，檢測上清液中的乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）含量以行細(xì)胞毒性分析；MTT呈色法繪制心肌干細(xì)胞增殖曲線；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定上清液中胰島素樣生長因子-1(Insulin like Growth Facto

4、r-l，IGF-1)和促血管生成素-2(angiopoietin-2)的含量。
　　結(jié)果：
　　1.傳代分選后細(xì)胞流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示，干細(xì)胞因子受體c-kit表達(dá)陽性，而成纖維細(xì)胞標(biāo)志 CD90、造血干細(xì)胞標(biāo)志 CD34、血源性標(biāo)志 CD45和Lineage以及內(nèi)皮標(biāo)志CD31表達(dá)陰性。Western Blot檢測結(jié)果顯示，心肌早期特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4結(jié)合蛋白表達(dá)陽性。
　　2.傳代分選后的細(xì)胞

5、分別經(jīng)5-氮雜胞苷、rh-PDGF-BB以及 bFGF三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，可分化成熟至表達(dá)心肌細(xì)胞特異的CX43和cTnT蛋白，平滑肌細(xì)胞獨(dú)有的a-SMA蛋白，以及內(nèi)皮細(xì)胞的vWF因子。
　　3.波長660nm的低能激光在0.50-5.00 J/cm2能量密度下照射，對(duì)體外培養(yǎng)的心肌干細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性。
　　4.低能激光照射對(duì) CSCs的增殖速率有促進(jìn)作用，最佳能量密度可能為0.75J/cm2； LLLI能夠促進(jìn)心肌干細(xì)

6、胞分泌IGF-1及angiopoietin-2，最適能量密度可能是3J/cm2。
　　結(jié)論：
　　1.自成年小型豬右心耳組織成功分離獲得c-kit+、CD31-、CD34-、CD45-、CD90-、Lineage-的心肌干細(xì)胞，并且具有多向分化潛能，能在體外實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定擴(kuò)增。
　　2.波長660nm的低能激光照射劑量為0.50-5.00 J/cm2，可安全用于體外培養(yǎng)心肌干細(xì)胞的預(yù)處理。
　　3.低能激光照射能夠提高