脂肪酶催化制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂和阿魏酰結(jié)構(gòu)磷脂.pdf

1、中碳鏈結(jié)構(gòu)脂具有供能及時(shí)，改善人體對(duì)長(zhǎng)碳鏈脂肪酸的吸收，滿足人體對(duì)必需脂肪酸的需求，彌補(bǔ)長(zhǎng)碳鏈甘三酯和中碳鏈甘三酯的缺陷等優(yōu)點(diǎn)，其為制備腸道藥品和腸胃營(yíng)養(yǎng)品脂肪乳的重要原材料。中碳鏈結(jié)構(gòu)脂特殊的脂肪酸定位分布，傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑難以勝任其制備工作，脂肪酶以其具有位置選擇性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)成為制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂的重要生物催化劑。但目前報(bào)道的酶法制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂方法中存在脂肪酶價(jià)格高，底物侵蝕脂肪酶致其失活和批式反應(yīng)中原料及能耗大等缺陷。本

2、文主要針對(duì)以上存在的問題進(jìn)行了如下研究。
　　阿魏酸(Ferulicacid，F(xiàn)A)是一種天然的抗氧化劑，具有清除自由基、保護(hù)細(xì)胞、抑制血栓素釋放、抗癌、抗菌消炎等功能，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域。但由于FA在油相和水相體系中的溶解度都較低，很難滲透進(jìn)入生物脂質(zhì)層發(fā)揮作用，因此FA衍生物的制備成為熱點(diǎn)問題。磷脂是細(xì)胞膜的基本組成成分，對(duì)維持細(xì)胞的通透性和細(xì)胞內(nèi)氧的傳遞起著重要作用。若將FA分子結(jié)合到磷脂分子上，可以有效解決

3、其生物利用度低的問題，同時(shí)可以保證FA的生理活性不受影響。由于FA和磷脂均為熱敏性物質(zhì)，本文利用脂肪酶催化制備阿魏酰結(jié)構(gòu)磷脂(FLPs)，同時(shí)對(duì)其合成路線、反應(yīng)介質(zhì)的選擇、結(jié)構(gòu)表征及反應(yīng)條件的優(yōu)化進(jìn)行了研究。
　　在無溶劑體系下，選擇以中碳鏈脂肪酸（辛酸、癸酸）為?；w、以LipozymeRMIM為最佳生物催化劑制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂?；谀繕?biāo)產(chǎn)物的特定要求（如配方FE73403），考察了不同反應(yīng)條件，包括脂肪酸摩爾比、底物摩爾比、反

4、應(yīng)溫度、加酶量、酶的重復(fù)利用次數(shù)，對(duì)脂肪酸插入率的影響。在反應(yīng)條件為辛酸、癸酸摩爾比4∶1，底物（酸/大豆油）摩爾比6∶1，溫度55℃，加酶量7wt％（以總底物質(zhì)量計(jì)），反應(yīng)4h可達(dá)到目標(biāo)配方FE73403的要求，并且酶可以重復(fù)利用12次以上。用分子蒸餾法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了分離純化，分餾產(chǎn)品的甘三酯含量達(dá)90％以上，羥值為9.71，脂肪酸組成及sn-2脂肪酸組成符合目標(biāo)配方FE73403要求。另外，對(duì)該反應(yīng)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究。反

5、應(yīng)的活化能為21.1kJ/mol，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vm分別為2.28mol/L和18.52mol/(L×min)。
　　為了降低底物對(duì)固定化脂肪酶載體的侵蝕，增加脂肪酶的催化活性，建立了新的反應(yīng)體系，以實(shí)驗(yàn)室自制中碳鏈脂肪酸乙酯（純度達(dá)90％以上）為酰基供體、以價(jià)格便宜的脂肪酶LipozymeTLIM為生物催化劑制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂?；谀繕?biāo)配方FE73403，考察了不同反應(yīng)條件，包括脂肪酸乙酯摩爾比、底物摩爾比、反應(yīng)溫度、加

6、酶量，對(duì)脂肪酸插入率的影響。在反應(yīng)條件為辛酸乙酯、癸酸乙酯摩爾比3∶1，底物（乙酯/大豆油）摩爾比6∶1，反應(yīng)溫度60℃，加酶量13wt％（以總底物質(zhì)量計(jì)），反應(yīng)可較快達(dá)到目標(biāo)配方FE73403的要求。同時(shí)考察了脂肪酶的重復(fù)利用次數(shù)，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行12批次(每批次12h)時(shí)，脂肪酶的活力降低明顯，該酶穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。該反應(yīng)的活化能為30.1kJ/mol，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vm分別為4.02mol/L和4.94mol/(L×min

7、)。
　　為了有效解決批式反應(yīng)中原料、能耗大及生產(chǎn)能力低等問題，本文利用中碳鏈甘三酯(MCT)為?；w，設(shè)計(jì)并組裝了固定床連續(xù)反應(yīng)裝置，優(yōu)化了連續(xù)法制備中碳鏈結(jié)構(gòu)脂的工藝參數(shù)，對(duì)脂肪酶的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，并用不同極性的溶劑（丙酮、異丙醇、叔丁醇和異丁醇）處理使用過的脂肪酶，對(duì)酶的循環(huán)使用進(jìn)行了研究。通過批式反應(yīng)中比較了兩種酶的催化性能，盡管LipozymeRMIM的sn-1，3位專一性較好，但LipozymeTLIM具有明顯的價(jià)

8、格優(yōu)勢(shì)，后續(xù)研究采用價(jià)格低廉的脂肪酶LipozymeTLIM。連續(xù)反應(yīng)最佳保留時(shí)間及反應(yīng)溫度為30-40min和55℃，在此條件下，連續(xù)反應(yīng)204h后，LipozymeTLIM酶活損失較大，經(jīng)丙酮處理后，該酶至少可循環(huán)使用四批次，可使反應(yīng)的轉(zhuǎn)酯化度從40％提高至55％左右。
　　本文初步建立了以磷脂酰膽堿(PC)與阿魏酸乙酯(EF)為底物脂肪酶催化制備FLPs的反應(yīng)體系以及定性定量分析產(chǎn)物的方法，開發(fā)了一條兩步酶法制備FLPs的反

9、應(yīng)路線:第一步在脂肪酶催化下水解底物PC制得溶血磷脂酰膽堿(LPC)和甘油磷脂酰膽堿(GPC)，第二步將EF加入上述反應(yīng)體系中，在脂肪酶催化下制備FLPs。對(duì)不同來源的脂肪酶及反應(yīng)體系進(jìn)行了篩選，最佳生物催化劑和反應(yīng)介質(zhì)分別為Novozym435和甲苯。利用制備型高效液相色譜制備了高純產(chǎn)物—1-阿魏酰-溶血磷脂酰膽堿(1-FLP)，通過TLC、HPLC、LC-MS和核磁共振對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，確定了合成產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)為1-FLP。

10、r>　　對(duì)利用PC和EF為底物制備FLPs的反應(yīng)條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化，最佳反應(yīng)條件為:甲苯/三氯甲烷(90∶10，v/v)5mL，PC最佳水解時(shí)間1.5h，底物摩爾比(PC∶EF)5∶1，最佳脂肪酶Novozym435用量60mg/mL，反應(yīng)溫度55℃，4(A)分子篩100mg/mL。在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)4天，F(xiàn)LPs轉(zhuǎn)化率可提高至40.15±1.25％。通過響應(yīng)面曲線法對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了綜合優(yōu)化，最佳反應(yīng)條件是:底物摩爾比5∶1，PC水