清香大曲糖化酶的提取及宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、糖化酶是釀酒大曲的主要功能成分之一,不同大曲糖化酶活力及酶學(xué)特征都不同。一般大曲的研究多關(guān)注糖化酶的活力,而對糖化酶的來源不能確定。為了確定清香大曲糖化酶的微生物來源,進(jìn)一步了解清香白酒的功能微生物,本實(shí)驗(yàn)利用多種方法提取清香大曲糖化酶,并用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析清香大曲蛋白質(zhì)組成,為清香白酒功能微生物的確認(rèn)提供可靠信息。
　　本文采用PEG/(NH4)2SO4的雙水相體系對汾酒大曲的粗酶液進(jìn)行萃取,實(shí)驗(yàn)探討了PEG分子量和濃度

2、、(NH4)2SO4濃度等主要因素對糖化酶萃取的影響、并通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳的雙水相體系。結(jié)果表明,在PEG2000濃度16％,(NH4)2SO4濃度18％,pH為7.5,加入5％NaCl溶液的雙水相體系中,糖化酶的分配系數(shù)Ka和回收率Yt分別達(dá)到1.913和83.25％。該體系是一種高效、便捷的體系,為汾酒大曲的深入研究提供有效的理論依據(jù)。
　　采用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀、硫酸銨等沉淀法制備汾酒大曲的宏蛋白質(zhì)組樣品,并用雙

3、向電泳來檢測制備效果,結(jié)果表明:TCA-丙酮沉淀法制備的樣品經(jīng)電泳分離后,減輕了雜質(zhì)干擾,2-DE圖譜中豎條紋干擾較少,獲得的蛋白點(diǎn)形狀規(guī)則、清晰且無明顯重疊現(xiàn)象,優(yōu)于其它兩種方法;經(jīng)過兩次水化液溶解的蛋白樣品在等電聚焦時能保持4000伏較高電壓;上樣量為300ug左右的粗蛋白溶于二次水化液能得到點(diǎn)數(shù)更多、分辨率高的電泳圖譜。最終建立了汾酒大曲宏蛋白質(zhì)組的雙向電泳體系。
　　通過對清香白酒生產(chǎn)常用的三種大曲從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度進(jìn)行質(zhì)

4、譜鑒定,共得到122個蛋白組分,其中56個蛋白組分種類包括烯醇酶、歧化酶、糖苷酶、糖化酶、各種激酶等,另外66個蛋白組分是輔酶及結(jié)構(gòu)蛋白組分。糖化酶是大曲的主要生化指標(biāo),大曲蛋白質(zhì)成分分析發(fā)現(xiàn),所有檢測到的糖化酶均為米根霉產(chǎn)生,由此確認(rèn)米根霉為清香白酒的功能菌。據(jù)推測清香白酒的酯化機(jī)制除了胞外酯化酶外,還有酵母菌胞內(nèi)完成的?；D(zhuǎn)移酶形成,本實(shí)驗(yàn)檢測到只有釀酒酵母合成的乙醇-O-酰基轉(zhuǎn)移酶,確認(rèn)其為清香白酒酯化功能菌。為清香白酒釀造功能微