龍井43號多酚氧化酶同工酶質(zhì)譜鑒定與酶性質(zhì)研究.pdf

1、多酚氧化酶(PPO)多年來一直是國內(nèi)外研究的熱點，對茶葉品質(zhì)的形成起關(guān)鍵作用，然而目前缺乏深入開展PPO單一同工酶的研究。本課題以龍井43號為材料，通過硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠層析等獲得3個PPO單一同工酶PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ，通過MALDI串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀）對3個同工酶進行了初步鑒定。并對PPOⅡ酶性質(zhì)進行了分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1、PPO同工酶的獲取
　　以緩沖液

2、浸提、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B離子交換層析、Sephadex G-150凝膠過濾層析等步驟可以有效地分離純化茶樹PPO同工酶。經(jīng)以上各步分離純化，共獲得3個茶樹PPO同工酶，分別為PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ，比活力分別為964.63、2325.39、2406.78U/mg，分子量分別約為34kDa、53kDa、85kDa。
　　2、茶樹PPO同工酶質(zhì)譜鑒定
　　通過質(zhì)譜鑒定PPOⅠ、PPOⅡ

3、、PPOⅢ，經(jīng)檢索得到四種類似的物質(zhì):胞質(zhì)核糖體蛋白、乳酰谷胱甘肽裂解酶、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基蛋白和蛋氨酸合成酶，前兩個為PPOⅠ檢測結(jié)果，后兩個分別為PPOⅡ和PPOⅢ檢測結(jié)果。
　　PPOⅠ檢測得到兩種類似物質(zhì):一種類似于茶樹(Camellia sinensis)的胞質(zhì)核糖體蛋白(cytoplasmic ribosomal protein)，分子量為17267Da，pI10.26;另一種類似片段來源于水稻

4、中的乳酰谷胱甘肽裂解酶(Lactoylglutathione lyase)，分子量為32875Da,pI5.51。
　　PPOⅡ類似于存在于茶科植物Franklinia alatamaha中的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基蛋白(ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit protein)，該物質(zhì)分子量為53050Da，pI6.13。PPOⅡ可

5、能與光合作用有關(guān)。
　　PPOⅢ類似于存在于茶樹（Camellia sinensis）中分子量為85180Da，pI6.14的蛋氨酸合成酶(methionine synthase)。該物質(zhì)可能與蛋氨酸和葉酸循環(huán)有關(guān)，調(diào)節(jié)生物體的生理過程。
　　3、PPO同工酶酶學(xué)性質(zhì)研究
　　以鄰苯二酚為底物，采用分光光度法對茶葉多酚氧化酶同工酶進行抑制劑、溫度、pH、Cu2+濃度等酶學(xué)性質(zhì)的研究。結(jié)果表明:同工酶PPOⅡ最適pH為6