β2-微球蛋白特異性血液凈化吸附劑制備及性能研究.pdf

1、β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2M)是主要組織相容性復合體(majorhistocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子的輕鏈，參與免疫應答和細胞間相互識別。在慢性腎衰竭患者體內，β2M不能被正常代謝去除，也無法被普通透析有效清除，因此在體內累積，誘發(fā)透析相關性淀粉樣變，是腎衰患者透析并發(fā)癥的主要致病毒素。血液凈化吸附去除β2M的治療方式已被臨床普遍采納，但目前所采用的非特異性吸附劑由于目標選擇

2、性差，存在低效、高副作用的缺陷。本論文提出了一種基于駝源納米抗體的高選擇性免疫吸附劑的制備策略，針對人β2M篩選并制備了高親和力納米抗體，以此為配基合成吸附劑并驗證了其應用于血液凈化去除β2M的可行性，具體內容如下:
　　(1)抗β2M納米抗體的篩選。應用噬菌體展示庫技術篩選納米抗體，經過4輪篩選，挑取了233個單克隆噬菌體樣品進行ELISA比較親和活性，獲得了30個親和活性較好的噬菌體樣品，測序去除重復和錯誤序列后，獲得13種高

3、親和活性的納米抗體序列，其中來源于免疫庫的有11種，這體現了免疫庫的多樣性。通過再次ELISA比較，最終確定4種親和活性最高的納米抗體序列A55、A82、A107、B82。
　　(2)納米抗體的制備與親和活性檢測。通過基因工程手段構建4種納米抗體重組表達載體，分別轉入兩種宿主菌中，宿主E.coli Shuffle T7的可溶納米抗體表達量優(yōu)于E.coli Origami2。使用鎳柱親和純化，獲得了6種純度90％以上的納米抗體，即A

4、55S、A107S、B82S、A82S、A55O、A82O，其中產量最高的是A55S，達到100 mg/L。通過ELISA和Biacore分別定性和定量比較納米抗體的親和活性，發(fā)現納米抗體A55S的親和力最高，平衡解離常數(KD)達到2.931×10-6M。
　　(3)免疫吸附劑的制備與評價。通過比較5種納米抗體吸附劑的制備方法，發(fā)現使用ε-聚賴氨酸作為間隔臂的吸附劑D效果最好，但配基密度要控制，太高會引起納米抗體蛋白多點固載，導

5、致蛋白失活。在β2M上樣濃度2 mg/mL的條件下，吸附劑D1對β2M的動態(tài)吸附容量高達11.45 mg/mL，但是相同條件的血漿體系中，其動態(tài)吸附容量會顯著降低，血漿中其它物質的非特異性吸附影響了β2M的吸附。
　　總之，本論文通過噬菌體展示庫技術篩選得到了高親和活性的納米抗體序列，并表達純化出抗體蛋白，測定其親和力，最后制備免疫吸附劑探索其應用于血液凈化的可行性。然而，較強的非特異性吸附影響了吸附劑對β2M的去除效果，提高納米