W-O-W型人參莖葉皂苷復(fù)乳佐劑的制備及其佐劑效果的研究.pdf

1、人參是具有悠久歷史的名貴中藥，其藥用價(jià)值已經(jīng)被世界公認(rèn)，其性溫、平，味甘、微苦，入脾、胃、肺三經(jīng)，具有復(fù)脈固脫、滋陰補(bǔ)腎、補(bǔ)脾益肺、安神益智的功效。人參皂苷是人參最主要的活性成分，也具有抗炎抗菌、抗微生物、抗寄生蟲、抗腫瘤、抗病毒等作用。近代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人參莖葉皂苷(GSLS)也具有與人參皂苷相似的藥理活性，且成本較低。胡松華等人也發(fā)現(xiàn)人參皂苷和油包水疫苗有很好的協(xié)同作用，可以顯著提高機(jī)體的免疫應(yīng)答。W/O/W復(fù)乳是一種可包裹水溶性

2、活性物質(zhì)的多重乳液，可以實(shí)現(xiàn)水溶性活性物質(zhì)的隔離、保護(hù)、可控釋放等。本試驗(yàn)旨在制備一種W/O/W型人參莖葉皂苷復(fù)乳佐劑，W/O/W復(fù)乳的內(nèi)水相為抗原和人參莖葉皂苷的水溶液，可實(shí)現(xiàn)抗原和人參莖葉皂苷的可控釋放，結(jié)合人參莖葉皂苷和W/O/W復(fù)乳的免疫增強(qiáng)作用以期達(dá)到減少疫苗用量、減少免疫次數(shù)、提高免疫效果的效果。本研究主要包括人參莖葉皂苷的提取方法的篩選、W/O/W人參莖葉皂苷復(fù)乳佐劑的制備及提高GSLS的包封率研究、W/O/W人參莖葉皂苷

3、復(fù)乳佐劑的佐劑效果研究等幾個(gè)方面，旨在開發(fā)出一種質(zhì)量可控、免疫效果良好的新型疫苗佐劑。
　　試驗(yàn)Ⅰ人參莖葉皂苷的提取與純化人參莖葉皂苷具有和人參相似的藥理作用，而且成本較低。煎煮法是一種比較傳統(tǒng)的中藥成分提取方法，本試驗(yàn)主要通過對煎煮法得到的人參莖葉皂苷提取液分別進(jìn)行4中不同的處理方法，即直接烘干、30％的乙醇純化、60％的乙醇純化和將提取液先過大孔吸附樹脂柱再用60％乙醇純化4種方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種處理方法得率分別為26.2％、

4、24.3％、17.7％、5％。高校液相色譜法測的4種處理方法得到的人參莖葉皂苷純度分別為18.37％、25.86％、38.54％、49.99％?？紤]成本、得率等多種因素，煎煮法提取后，后續(xù)的試驗(yàn)研究均采取用60％乙醇純化方法得到的人參莖葉皂苷。
　　試驗(yàn)ⅡW/O/W型人參莖葉皂苷復(fù)乳的制備以及優(yōu)化采用預(yù)試驗(yàn)中優(yōu)化的方法制備W/O/W型GSLS復(fù)乳。首先對GSLS復(fù)乳的粒徑、粘度、穩(wěn)定性進(jìn)行檢測;其次以高效液相色譜的方法檢測GSLS

5、復(fù)乳中人參莖葉總皂苷的含量;最后選用油相含水相的質(zhì)量比、乳化時(shí)間、乳化強(qiáng)度作為考察因素，以GSLS復(fù)乳中人參莖葉皂苷的包封率為評價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)表選取合適的工藝條件。結(jié)果顯示，GSLS復(fù)乳的粒徑在0.086～0.115μm的范圍內(nèi)，平均粒徑為110 nm，粒度均勻;粘度和穩(wěn)定性均正常;高效液相色譜檢測出GSLS濃度為0.5 mg/mL的復(fù)乳中每毫升含人參皂苷Rg1在17.82μg～23.68μg，人參皂苷Re在27.82μg～33.

6、68μg，人參皂苷Rd在16.82μg～23.08μg范圍內(nèi);正交試驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)乳中GSLS包封率最高的條件為油相和水相的質(zhì)量比為46∶54，乳化時(shí)間30min，乳化強(qiáng)度為300rpm。
　　試驗(yàn)Ⅲ W/O/W型人參莖葉皂苷復(fù)乳對FMDV免疫小鼠的免疫應(yīng)答的影響為探究W/O/W型人參莖葉皂苷復(fù)乳對FMDV免疫小鼠的免疫應(yīng)答的影響，本試驗(yàn)將96只6周齡的ICR雄鼠隨機(jī)分為6組，分別以生理鹽水、ISA206、空白W/O/W復(fù)乳、人參莖

7、葉皂苷提取液、空白W/O/W復(fù)乳+人參莖葉皂苷提取液、包裹人參莖葉皂苷的W/O/W復(fù)乳為FMDV疫苗佐劑進(jìn)行頸部皮下免疫，于免疫后第14、21、28、42、49、56d摘眼球采血，測定FMDV特異性IgG抗體和細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ的濃度變化;每組小鼠每次共撲殺3只，采用MTT法測定脾臟淋巴細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果表明，包裹人參莖葉皂苷的W/O/W復(fù)乳佐劑能夠顯著增加血清中IgG、IL-4和IFN-γ的濃度，同時(shí)對小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞有