東方巴貝斯蟲新型診斷方法的建立和基因組序列測定與分析.pdf

1、東方巴貝斯蟲(Brabesia orientalis)是一種蜱傳性血液原蟲,由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播,僅對水牛致病。該病主要在我國長江以南地區(qū)發(fā)生和流行,臨床癥狀主要為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等,嚴(yán)重時導(dǎo)致死亡,對我國的水牛養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對東方巴貝斯蟲的形態(tài)學(xué)、流行病學(xué)、生活史、診斷方法以及分子分類學(xué)等進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究,但仍缺乏快速高效、敏感特異、實(shí)時定量的檢測方法,同時關(guān)于東方巴貝斯蟲基因組的研究也未有

2、報道。
　　 為此,本研究首先建立了東方巴貝斯蟲反向線性斑點(diǎn)雜交(RLB)技術(shù),并利用該方法對中國湖北地區(qū)水牛、梅花鹿和南非比勒陀利亞的綿羊和山羊血液樣品的血液原蟲進(jìn)行了鑒定和流行病學(xué)調(diào)查；隨后建立了東方巴貝斯蟲環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(LAMP)、實(shí)時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測方法,并利用這兩種方法分別對湖北地區(qū)的水牛的東方巴貝斯蟲進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查；利用東方巴貝斯蟲陽性血清對東方巴貝斯蟲cDNA文庫進(jìn)行免疫篩選,

3、克隆和表達(dá)了3個免疫相關(guān)基因；對東方巴貝斯蟲基因組進(jìn)行了序列測定和初步分析；克隆、注釋了東方巴貝斯蟲的線粒體基因組,并對該基因組進(jìn)行了多態(tài)性分析。
　　 (1)東方巴貝斯蟲反向線性斑點(diǎn)雜交(RLB)檢測方法的建立與應(yīng)用利用巴貝斯蟲和泰勒蟲18S.rRNA的v4高變區(qū)兩端的保守區(qū)設(shè)計一對屬特異性引物RLB-F和RLB-R(Gubbels et al.,1999),并根據(jù)東方巴貝斯蟲(B.orientalis)18SrRNA基因v4

4、高變區(qū)設(shè)計特異性探針,建立東方巴貝斯蟲RLB檢測方法,運(yùn)用建立的方法對采自中國湖北省9個不同地區(qū)的304份水牛血液樣品進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明,感染湖北地區(qū)水牛的梨形蟲有4種,分別是水牛泰勒蟲、東方巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲,其陽性率分別是19.1％(58),8.9％(27),1％(3)和0.7％(2)；用RLB檢測了采自湖北省的24份梅花鹿血樣、南非比勒陀利亞的82份綿羊和244份山羊血樣。結(jié)果表明,梅花鹿、綿羊和山羊樣品都沒有任

5、何巴貝斯蟲的雜交信號,三種樣品的泰勒蟲陽性率分別是29.20％(7/24)、28.0％(23/82)和0.8％(2/244)。多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,可能存在鹿的泰勒蟲新種,南非樣品結(jié)果顯示犀牛泰勒蟲(T.bicornis)和黑貂泰勒蟲未定種(T.sp.sable)探針的特異性探針與分離泰勒蟲(T.separata)等羊的泰勒蟲的18S rRNA相似度極高,探針的特異性較低,存在交叉反應(yīng)。
　　 (2)B.oriental

6、is環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(LAMP)檢測方法的建立依據(jù)東方巴貝斯蟲18S rRNA的v4高變區(qū),用LAMP引物設(shè)計專用軟件,設(shè)計4條識別目的片度6個特異性位點(diǎn)的引物,建立東方巴貝斯蟲LAMP快速診斷方法。特異性試驗(yàn)表明,LAMP僅能擴(kuò)增東方巴貝斯蟲的DNA模板,而與其他的梨形蟲DNA無任何特異性擴(kuò)增。用該方法檢測77份長江以南、88份長江以北的水牛血液樣品和66份非洲水牛樣品。結(jié)果表明,南非水牛樣品全部陰性,77份長江以南和88份長江以北的樣

7、品,LAMP檢測的陽性分別是24份和6份,半巢式PCR檢測的陽性分別是12份和1份。檢測結(jié)果表明本研究成功建立了特異性高、敏感性強(qiáng)、快速簡便的東方巴貝斯蟲LAMP檢測方法,流行病學(xué)調(diào)查和統(tǒng)計分析顯示,本試驗(yàn)建立的LAMP方法比此前報道的半巢式PCR更敏感,且東方巴貝斯蟲已經(jīng)從長江以南流行到長江以北。
　　 (3)B.orientalis實(shí)時定量檢測方法的建立利用東方巴貝斯蟲18S rRNA的v4高變區(qū)設(shè)計TaqMan實(shí)時定量PC

8、R的引物和探針,建立東方巴貝斯蟲的實(shí)時定量PCR檢測方法(TaqMan real-time PCR)。該方法的檢測極限是每微升2個蟲體,特異性試驗(yàn)表明僅東方巴貝斯蟲DNA有特異性的擴(kuò)增曲線。用實(shí)時定量PCR和RLB分別檢測180份湖北地區(qū)的水牛血液樣品。結(jié)果表明,兩種方法分別檢測的陽性樣品分別為28份和21份,其中長江以北分別檢出16份和12份陽性；陽性樣品的染蟲率范圍是2.0×105～2.0×100,其中有16份的染蟲率為2.0×10

9、0～2.0×102。試驗(yàn)結(jié)果表明所建立的實(shí)時定量PCR方法能有效、定量檢測東方巴貝斯蟲。
　　 (4)B.orientalis免疫相關(guān)基因的克隆表達(dá)利用東方巴貝斯蟲陽性血清篩選東方巴貝斯蟲cDNA文庫,共得到18個陽性克隆子,經(jīng)EST序列分析,挑選其中的3個可能與免疫相關(guān)的基因:B04——核動蛋白基因、B05——假定蛋白基因和B41——熱休克蛋白70基因(HSP70),克隆各自的ORF,分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-B04

10、,pET-28a-B05和pET-32a-B41,在RosettaTM中高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后western blot分析,結(jié)果表明三個基因都有良好的抗原性,且證明了HSP70在東方巴貝斯蟲中的存在。HSP70基因的核苷酸序列進(jìn)化分析表明東方巴貝斯蟲是一歸屬于巴貝斯蟲的獨(dú)立新種。
　　 (5)B.orientalis基因組測序本試驗(yàn)對東方巴貝斯蟲基因組采用的Pair-end雙末端測序進(jìn)行了Solexa測序。共獲得23,898

11、,916個讀長,測序數(shù)據(jù)量為2,389,891,600,測序深度約為306.5倍。剔除污染和低質(zhì)量的讀長,組裝拼接后共獲得1284個Scaffold,總長度為7,796,224bp,GC含量42.4％,與已發(fā)表的牛巴貝斯蟲T2B株基因組GC含量41.8％相一致。結(jié)合本試驗(yàn)分析的結(jié)果和已報道的牛巴貝斯蟲和小泰勒蟲基因組信息,分析東方巴貝斯蟲有4條染色體,基因組大小約為7.9 Mb。由于真核生物基因組非常復(fù)雜,而且目前所能參考的梨形蟲基因組

12、信息相對有限,對東方貝斯蟲基因組的具體注釋還有待進(jìn)一步研究。
　　 (6)B.orientalis線粒體基因組(mitochondrion DNA,mtDNA)克隆和多態(tài)性分析根據(jù)基因組測序的高通量序列和cDNA文庫釣取的部分mtDNA序列,結(jié)合NCBI公布的頂器門血液原蟲mtDNA序列,選擇其保守區(qū)設(shè)計引物,克隆東方巴貝斯蟲mtDNA并做多態(tài)性分析。測序結(jié)果用Staden package軟件進(jìn)行拼接,Artemis_v11對東

13、方巴貝斯蟲的mtDNA進(jìn)行注釋。結(jié)果表明,東方巴貝斯蟲mtDNA與已報道的巴貝斯蟲和泰勒蟲mtDNA相似,也含有3個編碼區(qū),即細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ),細(xì)胞色素氧化酶Ⅲ(COXⅢ)和細(xì)胞色素b(cytochrome b,Cytb),其大小分別為1428bp,687 bp和1092 bp,其中COXⅠ位于正義鏈,COXⅢ和Cytb均位于反義鏈上。mtDNA的COXⅠ、Cytb以及COXⅠ和Cytb結(jié)合序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明三種序列

14、得到的結(jié)果與18S rRNA基因和熱休克蛋白70(HSP70)基因進(jìn)化分析的結(jié)果一致,即東方巴貝斯蟲歸屬于巴貝斯蟲分支。東方巴貝斯蟲mtDNA的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)其有99個多態(tài)性位點(diǎn)。
　　 本研究建立的東方巴貝斯蟲反向線性斑點(diǎn)雜交(RLB)、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(LAMP)和實(shí)時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測方法為進(jìn)行東方巴貝斯蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查以及反芻動物血液原蟲新蟲種的發(fā)現(xiàn)及潛在風(fēng)險評估等提供了條件；東方巴貝斯