AFM力譜技術(shù)研究金屬離子對(duì)β淀粉樣蛋白異常聚集的影響.pdf

1、蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)的功能活動(dòng)的主要執(zhí)行者，許多人類疾病與蛋白質(zhì)的異常聚集事件有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，因此研究蛋白質(zhì)的聚集及其相互作用對(duì)新藥的發(fā)展顯得尤為重要。近年來(lái)，利用原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)技術(shù)在單分子水平上理解生物分子間的相互作用已成為生物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)中重要的研究方法學(xué)。阿茲海默癥(AD)患者大腦中β淀粉樣蛋白(amyloid-β protein, Aβ)的異常聚集是AD發(fā)生的主要病理特

2、征，多項(xiàng)研究表明金屬陽(yáng)離子可能是Aβ異常聚集重要的環(huán)境誘導(dǎo)因素之一。然而現(xiàn)有的研究大多聚焦在熒光光譜、核磁共振等方法上，在單分子水平上開(kāi)展Aβ與金屬陽(yáng)離子間相互作用研究鮮有報(bào)道。本文力圖利用原子力學(xué)顯微技術(shù)，從單分子力學(xué)行為視角，通過(guò)附著力和摩擦力等力譜技術(shù)角度，討論金屬陽(yáng)離子對(duì)Aβ聚集的影響。主要開(kāi)展以下幾個(gè)方面的研究：
　?、倮米越M裝單分子層法(SAMs)，制備16-巰基烷基酸(MHA)分子膜，并將Aβ42分子共價(jià)連接于經(jīng)N

3、-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化后的MHA膜上，從而實(shí)現(xiàn)了Aβ42分子在金基底和鍍金探針表面的固定，獲得均一穩(wěn)定的Aβ42單分子層。通過(guò)輕敲模式原子力顯微鏡(TM-AFM)、接觸角(CA)、X射線光電子能譜(XPS)和掠入射X射線衍射(GIXRD)等方法對(duì)制備的單分子層進(jìn)行表征，結(jié)果顯示：1）從三維形貌圖可見(jiàn)，空白金層、MHA膜層和Aβ42單分子層三個(gè)不同表面有著不同表面粗

4、糙度和高度的差異性微結(jié)構(gòu)。2）CA測(cè)試顯示MHA膜和Aβ42單分子層均具有高親水的表面；不同摩爾比的MHA/正十二烷基硫醇(NDM)混合硫醇分子膜表面，隨著正十二硫醇所占的比例增大親水性降低、接觸角增大。3）空白金片、MHA膜和Aβ42單層的XPS結(jié)果表明各樣品表面測(cè)得的元素組成均與對(duì)應(yīng)膜層成分吻合。4）GIXRD測(cè)試結(jié)果進(jìn)一步表明，相比空白金片，MHA膜和Aβ42單分子層的特征吸收峰均發(fā)生了明顯變化，均在0~15°的2θ角范圍內(nèi)有特征

5、鋒。
　?、谠谝合喹h(huán)境下，利用TM-AFM對(duì)Aβ42聚集反應(yīng)進(jìn)行了成像研究，分別觀察了不同條件下Aβ42分子層在24、48、72h的形貌特征，結(jié)果表明：空白及不同金屬陽(yáng)離子溶液條件下的 Aβ42分子層表面微結(jié)構(gòu)各不相同，金屬陽(yáng)離子存在時(shí)Aβ42分子層有明顯的聚集特征，表現(xiàn)為分子層納米結(jié)構(gòu)以及表面粗糙度的變化?？瞻兹芤褐?，隨時(shí)間的增加，Aβ42分子層并無(wú)較大聚集特征顆粒出現(xiàn)；而金屬離子存在條件下，Aβ42分子層表面形貌呈現(xiàn)出較大的聚

6、集特征納米顆粒。由形貌學(xué)的角度可見(jiàn)，金屬陽(yáng)離子對(duì)Aβ42分子間二聚化以及寡聚化反應(yīng)的進(jìn)行具有明顯的促進(jìn)作用。
　?、劾肁FM接觸模式，對(duì)空白和不同金屬陽(yáng)離子溶液環(huán)境下Aβ42-Aβ42分子對(duì)的附著力（粘附力）行為進(jìn)行了研究。采用泊松分布法計(jì)算 Aβ42-Aβ42單分子對(duì)間粘附力，結(jié)果表明：對(duì)照實(shí)驗(yàn)（PBS溶液）中Aβ42-Aβ42單分子對(duì)間特異性相互作用力Fi為42±3 pN，而在Zn2+、Cu2+、Ca2+和Al3+存在條件下

7、Fi分別增大至89±3pN、84±6pN、73±5pN、95±5pN；可見(jiàn)金屬陽(yáng)離子的存在顯著增大了Aβ42分子間粘附力，由此可以推測(cè)Aβ42分子間粘附力的增大可能是誘導(dǎo)Aβ42分子間二聚化以及寡聚化的重要因素之一。
　?、芸疾炝瞬煌饘訇?yáng)離子濃度對(duì)Aβ42-Aβ42分子對(duì)間附著力影響的同時(shí)，討論了不同pH條件下金屬陽(yáng)離子對(duì)Aβ42異常聚集的影響。結(jié)果表明：金屬陽(yáng)離子濃度的增加，在一定程度上促進(jìn)了Aβ42-Aβ42間特異性相互作用

8、。在1μM~10μM濃度范圍內(nèi)，Aβ42-Aβ42特異性作用力 Fi隨金屬陽(yáng)離子濃度的增加而明顯增大趨勢(shì)，當(dāng)金屬陽(yáng)離子濃度大于10μM時(shí)Fi的增加不再明顯。不同pH條件下金屬離子對(duì)Aβ42異常聚集的影響研究顯示：當(dāng)pH值大于5.0時(shí)，金屬陽(yáng)離子的存在是增大了Aβ42-Aβ42間特異性粘附力的，促進(jìn)了Aβ42異常聚集的發(fā)生；而在pH小于5.0時(shí)則特異性粘附力大小接近對(duì)照組，形貌結(jié)果中也未觀察到Zn2+的影響作用，由此可推論蛋白質(zhì)質(zhì)子化抑制

9、了金屬離子的作用。
　　⑤在FFM（摩擦力學(xué)顯微技術(shù)）研究中，利用Aβ42修飾的底層分子層與Aβ42修飾的探針?lè)肿訉娱g的橫向力操作模式，考察了不同金屬離子溶液條件下Aβ42-Aβ42分子對(duì)間摩擦力學(xué)行為。結(jié)果顯示，金屬離子存在下，Aβ42-Aβ42分子層間摩擦力主要分布于150~400pN，空白對(duì)照組中摩擦力主要分布于50-150pN，表明金屬離子的存在對(duì)Aβ42分子層間摩擦力有較大的影響。對(duì)MHA/NDM混合硫醇所組裝的Aβ42

10、分子層進(jìn)行的摩擦力測(cè)試，結(jié)果表明：表面摩擦系數(shù)與表面粗糙度的變化趨勢(shì)一致，因此表面成分和結(jié)構(gòu)的改變是造成表面摩擦力差異的主要原因。對(duì) AFM測(cè)試中的法向加載力進(jìn)行設(shè)定，結(jié)果表明：法向加載力在0-4.0nN范圍內(nèi)，Aβ42分子層間表面摩擦力與加載力呈線性相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果說(shuō)明Aβ42分子層間的摩擦力變化與其聚集程度存在一定的相關(guān)性。
　　⑥采用表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）跟蹤金屬陽(yáng)離子作用于Aβ42前后的拉曼強(qiáng)度變化。對(duì)于Al3+而

11、言，可見(jiàn)Aβ42的Amide II中位于1375cm-1處的拉曼峰大大減弱，幾乎完全消失，1669cm-1處對(duì)應(yīng)于β-折疊峰也相比空白對(duì)照組下降，表明Aβ42的分子中有相當(dāng)一部分酰胺鍵與Al3+發(fā)生了相互作用，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。另外，觀察Aβ42單分子層中加入Zn2+與Cu2+的變化，可以很清楚的發(fā)現(xiàn)，兩者促使Aβ42的構(gòu)象變化所得譜圖非常接近，兩者中的的拉曼峰值強(qiáng)度比例(I1375/I1669)幾乎相等，由此說(shuō)明Zn2+、Cu2+與Aβ4

12、2的結(jié)合程度是非常相近的。而在加入Ca2+溶液條件下，相對(duì)于在生理溶液中的拉曼強(qiáng)度，其在含有Ca2+的溶液中β-折疊(1669cm-1)拉曼峰強(qiáng)減弱，但相比Zn2+、Cu2+而言Ca2+對(duì)Aβ42發(fā)生的β-折疊和酰胺鍵的構(gòu)象轉(zhuǎn)變程度最小，這一結(jié)果與原子力學(xué)顯微技術(shù)所觀察的結(jié)果相吻合。
　　總之，本文從AFM的粘附力和摩擦力角度出發(fā)并借助SERS跟蹤技術(shù)，討論了Aβ42-Aβ42分子層間相互作用的力學(xué)行為，以及金屬陽(yáng)離子對(duì)這一作用的